3提示提高人类细胞中Crispr效率的HDR效率

由Guest Blogger.

这篇文章由Guest Bloggers Dominik Paquet和Dylan Kwart来自Ludwig-Maximilians-University在慕尼黑和Marc Tessier-Lavigne在纽约洛克菲勒大学的实验室。

CRISPR / CAS9.系统是许多生物和模型系统中的精确基因编辑的多功能工具。我们已经广泛使用了CRISPR / CAS9,以便在人类中进行序列的变化诱导多能干细胞(IPSC)。CRISPR / CAS9复合物在许多细胞类型中将双链破碎(DSB)引入基因组DNA时非常有效,并且经常导致双挠曲修饰。最常见的是,DSB被修复非致力学终端连接(NHEJ)途径,导致非特异性核苷酸插入,缺失或其他突变,称为“Indels”。虽然这方便生成基因敲除,但NHEJ修复不允许引入特定的序列变化。

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要生成特定的序列,细胞必须经历同源导向修复(HDR),一种明显的细胞DNA修复途径。实现这通常涉及同时引入同源DNA修复模板,例如单链寡脱氧核苷酸(SSODN),其含有预期的序列变化以结合到编辑的基因组中。在哺乳动物等干细胞如干细胞中,HDR是相对罕见的,DSB主要由NHEJ修复。虽然其他团体专注于改善整体HDR率的策略,但我们最近显示了HDR的期望的基因组编辑事件,可以通过防止重新编辑和(2)优化“切割来提高编辑精度来更有效地产生(1)突变距离“。此外,(3),我们开发了一个框架,通过组合这两种策略允许您专门包含均匀或杂合的突变。

1.通过CRISPR / CAS阻塞突变提高HDR准确性

在2013年描述了用CRISPR / CAS9进行了基因组编辑(Cong等人mai等人)我们非常兴奋地在我们的实验室中设置基于CRISPR的编辑平台。我们的目标是使用该系统在IPSC中引入疾病突变(或将它们纠正回野生型),将它们分化为受疾病影响的体细胞,并研究细胞出现问题。然而,当我们测序我们的细胞时,我们的兴奋变得令人沮丧,发现我们的编辑是多么低。虽然我们能够在与痴呆症相关的基因中引入所需的突变,例如APP和PSEN1,在大多数情况下,预期的HDR事件被同一等位基因上的不需要的indels损坏,可能是由于伴随的NHEJ修复。在PSEN1基因座,超过90%的HDR编辑的等位基因有不需要的插入/缺失,因此使这些等位基因对我们的研究无用。如果现在还考虑到HDR是罕见的,通常在我们手中的2-5%的编辑细胞中,这些联合陷阱几乎不可能在筛选合理量的单细胞时找到0.2-0.5%正确编辑的等位基因克隆。此外,CRISPR / CAS9编辑通常是双位等位基因的,这意味着即使准确地编辑了一个等位基因,另一个等位基因也可能包含不需要的indel。

Following this observation, we tested a strategy that was discussed in the field at the time but had never been systematically analyzed: introducing silent CRISPR/Cas9 blocking mutations in either the PAM (changing one of the G’s to an A,T or C – but avoid NAG) or guide RNA target (“seed”) sequence. The idea was that these “blocking mutations” mutations prevent CRISPR from re-cutting the target sequence once the desired edit has been introduced.

我们发现阻断突变增加了每种等位基因每种等位基因的达到10倍的准确性。如果编辑单个小区中的两个等位基因,则这是一个100倍的编辑精度增加(Paquet,kwart等人2016)。对于您参与IPSC克隆挑选的繁琐业务的人来说,100倍的减少是拣选100与10,000个克隆之间的差异!因此,我们将强烈鼓励任何研究人员在基因编辑时在靶向等位基因中纳入CRISPR / CAS阻断突变。

提高CRISPR CAS9编辑效率的技术包括PAM阻塞突变和引导阻断突变。

但是什么更好:PAM阻止或引导RNA阻断突变?这完全取决于您正在编辑的轨迹,如果阻塞突变需要沉默。在我们看来,它总是最好改变PAM网站,但我们还表明了导向RNA阻断突变的效率。因此,如果轨迹不允许阻塞PAM序列(例如,如果它会导致坏话或非声义突变),则阻止导向RNA结合位点良好。但是,由于某些导向RNA可以容忍绑定序列中的不匹配,因此我们建议改变若干基础,尽可能接近PAM(见下文来了解原因)。有关详细信息,请查看我们最近的研究(PAQUET,Kwart等,和和kwart,paquet等,2017)。

如果您的轨迹不允许您使用永久性阻塞突变,例如在编辑非编码DNA区域时?为此,我们开发了一种称为正确的技术,通过进行两轮基因编辑,可以忽视引入预期的突变,同时利用阻断突变提供的提高效率。基本上,你:

步骤1- 将阻塞突变与预期的序列变化和屏幕介绍一百个克隆以找到合适的曲线

第2步- 使用纠正阻塞突变的修复模板,再次编辑单元格,并再次识别右克隆。

从这两个步骤中,您将筛选总共几百克隆 - 仍然优于10.000,右边?(kwart,paquet等,2017)。

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2.优化“切断距离”

尽管我们受到了过度活动的CAS9并用阻塞突变重复我们的实验,但我们仍然对我们的编辑结果完全满意,并且在许多情况下仍然没有得到我们想要的东西。吉尔斯从大多数HDR都读到了我们通过深度测序研究的,但有趣的是(以及我们的挫败感)在许多情况下,我们只申请纳入阻塞突变。尽管阻断突变和我们的预期突变都在相同的寡核苷酸上,但是目的突变很少进入。似乎只使用一部分修复模板和远离切割部位的突变没有有效地使用在HDR期间纳入。

突变的等位基因Z%较高,距离切位点几乎没有突变。我们决定系统地表征了这种现象,并发现了来自CRISPR / CAS9切位点的突变距离之间的一般关系,以及融合频率。我们感到惊讶地看到突变的效率如何达到距离切位点的距离增加。如果距离仅为10 BP,则效率已经下降了一半和之后只有约30bp,在没有筛选成千上万克隆以找到正面的突变是不可行的。所以,如果你有更好的事情要做,而不是克隆挑选,明智地选择您的指南RNA(让他们剪切)。

3.优化同性恋或杂合突变的“切割突变距离”

当进一步思考上述距离关系时,我们意识到,除了增加突变掺入效率之外,我们还可以利用这种关系来引导细胞的Zygosity。这对我们来说很重要,因为我们研究的阿尔茨海默蛋白突变是患者的杂合。随着突变掺入的概率随着越来越多的切割突变距离而下降,突变只能在其中一个等位基因中插入,但不是另一个 - 另一个效率对于一个预期两个成功的突变来说,编辑的效率太低了单细胞。

该图显示纯合的最佳距离是从切位点到突变的0和10个碱基,并且杂合编辑的最佳距离是从切割位点到突变的〜3至26个碱基。我们计算通过将单个等位基因突变掺入概率乘以我们的数据揭示的单一等位基因突变掺入概率来获得同源和杂合突变的可能性,并且发现用于以最佳效率产生纯合的HDR事件,靶向来自所需突变的切割<10bp的引导RNA用过的。对于杂合事件,切割应理想地应距离切割部位约为5至20兆位。最后,如果需要杂合事件但仅指导目标非常接近预期突变位点的RNA,则含有阻断和预期突变的修复模板可以与包含相同CRSPR / CAS阻塞突变的另一SSODN模板相同混合但不是预期的突变。这里,仅阻塞模板将与阻塞/预期的突变模板竞争,导致每个目标站点上使用一个或另一个的单元格。

在一起,为了高效和具体引入所需的HDR序列变化,最佳指南RNA不仅具有足够的目标和非常低的偏移活动,而且还应该在与预期突变部位的最佳距离处介导DSB,取决于所需的Zygosity。此外,通过将CRISPR / CAS阻塞突变掺入HDR修复模板中,应最小化引导RNA的重新编辑活性。


非常感谢我们的客人博客Dominik Paquet和Dylan Kwart

Dominik Paquet.Dominik Paquet目前是Ludwig-Maximilians-University研究所中风和痴呆症研究所神经生物学教授慕尼黑。他的实验室开发了基于IPSC的神经变性和神经血管疾病模型。他在纽约洛克菲勒大学的Marc Tessier-Lavigne的实验室中曾在描述的项目上工作。

dylan-01.pngDylan Kwart是洛克菲勒大学的研究生Marc Tessier-Lavigne的实验室。他目前正在通过开发基于IPSC的模型系统来了解阿尔茨海默病的病理机制。

参考

1。Cong,Le等。“使用CRISPR / CAS系统的多重基因组工程。”科学339.6121(2013):819-823。PubMed.PMID:23287718。pmed中央PMCID:PMC3795411

2。马里,Prashant等。“通过CAS9的RNA引导人类基因组工程。”科学339.6121(2013):823-826。PubMed.PMID:23287722。pmed中央PMCID:PMC3712628

3. Paquet,Dominik,等。“使用CRISPR / CAS9有效地引入特定的纯合和杂合突变。”自然533.7601(2016):125-125。PubMed.PMID:27120160

4.kwart,dylan等。“使用正确的干细胞在干细胞中精确和高效的无缺骨基因组。”自然协议12.2(2017):329-354。PubMed.PMID:28102837.

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