6分析和排除Sanger测序结果的提示

由Lianna Swanson.

DNA序列分析色谱图

这个博客最初发表于这里的BitesizeBio

我的工作之一就是保证质粒的质量Addgene,我每周分析50-100次测序反应。因此,我开发了一些良好的习惯,即我想传递给您,以确保您从排序运行中获得最大的数据。

当您在凝胶上运行限制摘要时,您始终包括正确的控制,如未切割的DNA和适当的梯子。这些控件可帮助您正确可视化您的结果。最重要的是,最重要的是始终密切关注您从您最喜欢的测序设施回馈的测序结果的跟踪文件(或色谱图)。

谈到DNA测序时,色谱图是您的视觉控制。而且,像所有控件一样,失踪是一个很大的错误。

色谱图来救援分析和故障排除您的DNA测序结果

上面(这个帖子的右上角)是看似清洁的DNA序列的一个例子(视线中没有NS)。如果你从未看过追踪,你会很开心。

但是仔细看,色谱图上的重叠峰表明结果并不像序列所显示的那样确定。事实上,这是如此模糊,DNA测序反应应该重复。

有助于DNA测序故障排除和分析的指导方针

1.您可以使用以下任何程序查看您的.ab1色谱图文件

2.您应该看到个人,尖锐且均匀的间隔峰

…像这些…。

DNA序列分析色谱图

3.期望获得500-700个清洁可靠的DNA序列

更少的任何内容,您都可能怀疑在样本中污染或考虑询问您的测序设施,以适用于困难模板的特殊协议。更重要的是,你冒险进入不确定的地形。

4.永远不要相信DNA测序的前20-30个碱基

这里的峰值通常是未解决的和小的,所以我建议在兴趣顺序上游至少50bp设计底漆。

5.使用硅胶旋转柱纯化您发送的样品,用于DNA测序

如果您的测序设施要求您进行自己的Big Dye PCR扩增反应(而不是使用所有包容性服务的公司提供),可以通过醋酸钠/异丙醇沉淀方法或使用可用的二氧化硅旋转柱净化产品来自几家供应商。沉淀方法具有令人满意的副作用,对读取的底座70-75周围的反应弄乱了反应(参见下面的图像),因此我强烈建议使用硅胶旋转柱。它们可能昂贵,但值得。

DNA序列分析色谱图

6.编辑您的DNA序列

最后,当你看到一个错误的山峰时,不要害羞。随意编辑它。大多数色谱图查看程序(即使是免费的)允许您编辑序列。

DNA序列分析色谱图

我希望这些提示可以帮助您充分利用您的DNA测序结果,并解决任何提出的问题。祝你好运分析你的序列!


更多DNA测序资源:

BitesizeBio标志确认:

  • 谢谢BitesizeBio.最初发布这一点并允许我们与读者分享它!

  • 本文中的色谱图是创建的SnapGene

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话题:分子生物学协议和提示质粒

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