一种适用于所有大肠杆菌菌株的cas9基因编辑系统

客人的博客

本文由四川师范大学讲师李琦、杨实验室实习生张杰泽和中国科学院合成生物学教授杨胜等客座博主撰稿。

PCAS / PTargetf系统是最受欢迎的基因组编辑系统之一E.杆菌。根据Addgene,SemonularCloud和我们的实验室的数据,PCA和PTargetf的总共有723和615个使用记录。但是,有些用户指出这个系统无法正常运行E.杆菌BL21(DE3)作为转化体在PTargetF转换到BL21(DE3)/ PCAS应变之后未能生长。我们的实验室在中国科学院优化了PCAS / PTargetf系统,并将其更新为PECCAS / Pecgrna系统。工作 ”用于在大肠杆菌中的CRISPR-CAS9辅助基因组编辑的改进的PCAS / PTargetf系统发表于2021年3月25日的《生物化学学报》和《生物物理学》。

原pCas/pTargetF系统

我们的原始pCas / pTargetF系统由一种表达的一种质粒组成S.化脓性链球菌Cas9,一种用于自我固化的温度敏感的复制品,一种阿拉伯糖诱导lambda-redpTargetF上的pMB1复制子的iptg诱导sgRNA序列。除了pMB1复制子外,pTargetF还包含了针对基因组位点的sgRNA。供体模板是单独提供的。

要使用这个系统,你首先要将你的sgRNA序列引入pTargetF结构,然后将这两个质粒引入细胞。染色体的编辑现在可以发生了。编辑后,pTargetF可以通过诱导靶向pMB1复制子的sgRNA的表达而从细胞中治愈,从而导致质粒的剪切。

在这一点上,随后引入包含另一个sgRNA的pTargetF,针对另一个感兴趣的位点,可以用来进行其他编辑。一旦你得到了你想要的所有编辑,通过在37°C培养细胞治愈pCas9。

新的PECCAS / PECGRNA系统

在本研究中,我们推测pTargetF的pMB1复制子特异性的pCas上的gRNA可能在BL21(DE3)中表现出更严重的漏表达,我们推测这是导致pTargetF被Cas9切割的原因。这将导致缺乏恢复的转化者。我们的猜测促使我们更新了pCas/pTargetF系统。

将pEcgRNA和pEcCas转化成大肠杆菌编辑基因组的原理图。质粒随后从细胞中被治愈。
图1:编辑过程以PecGRNA中的SGRNA序列的添加开始。接下来,两种质粒在大肠杆菌中转化为与供体DNA进行编辑以进行。然后质粒从细胞固化。步骤1-1和1-2可以同时完成。图片来自李等人,2021年

更新涉及以下更改。在PCAS9中,我们1)用PRHAB替代GRNA-PMB1的启动子,2)将PCA的复制子改为非温敏复制子,3)添加了SACB基因以获得屈服pEcCas。在pTargetF中,我们将pTargetF上原有的20bp特异性序列替换为末端含有BsaI限制性内切酶位点的ccdB基因进行生成pEcgRNA。的ccdB作为反选择标记并将被针对感兴趣的基因组位点的SGRNA所取代。

我们将PCAS / PTargetf系统与更新的PECCAS / PECGRNA系统进行比较,并确认了GRNA-PMB1在BL21(DE3)中具有稍微较高的泄漏表达,导致PTargetf系列质粒的转化效率较低。幸运的是,我们能够使用新生成的PECCAS / Pecgrna系统成功删除BL21(DE3)的感兴趣的基因。

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PECCAS / PECGRNA系统的优点

与原始系统相比,PECCAS / PecgrNA以多种方式优于:

  1. PECCAS质粒可在37℃下操作,以便更快地增长其E.杆菌宿主,添加SACB基因使其有利于质粒间隙。
  2. 更新Pecgrna质粒上的间隔物(20nt)是更方便的,因为只需要两种24个NT寡核苷酸,并且Bsai线性化的Pecgrna主链可以大量制备并冷冻以供将来使用或直接连接用退火的24 nt寡核苷酸来产生新的Pecgrna。
  3. Peccas / Pecgrna不仅可以应用于Coli K-12菌株,还可以应用E.杆菌B和W菌株。
  4. 优化后的质粒固化方法简单得多,由原来的~60小时缩短至~32小时。

我们成功地测试了4份佩奇/麦格纳系统E.杆菌k - 12株、2E.杆菌B株,1E.杆菌W株,1Tatumella citrea,共编辑了70个网站。优化质粒固化策略,为用户提供完整的编辑流程。如果你已经尝试了这个系统,我们很乐意听到你的反馈!


感谢我们的嘉宾博主!

齐丽敏齐莉获得了她的博士学位。来自中国科学院(CAS)2019年分子植物科学院卓越中心。她加入了四川师范大学,成为了一年同年生命科学学院的讲师。她的研究专注于微生物中基因组编辑的逃避机制,其可以应用于基因组编辑工具的优化。

Jieze-Zhang-min张洁泽是南加州大学生物化学专业的一名本科生。自2020年12月起,在中国科学院分子植物科学卓越中心杨实验室实习。他的研究重点是转座子编码的CRISPR/Cas系统在细菌中的效率,特别是对效率低的菌株进行优化。

盛阳照片

盛阳获得了他的博士学位。来自中国科学院上海生物化学研究所。他于2000年加入了上海对生物科学研究院,并成为2006年合成生物学教授。的杨实验室的研究专注于开发微生物基因组编辑工具,以便更快地构建或重新编程细胞,以了解其独特表型背后的遗传和生化机制,并为绿色化学和生物医学应用设计新一代的工程细胞。

引用和资源

引用:

姜艳,陈斌,段超,孙斌,杨军,杨松(2015)基于多基因编辑的遗传算法大肠杆菌基因组通过CRISPR-CAS9系统。Appl Environ Microbiol 81:2506-2514。https://doi.org/10.1128/aem.04023-14

李Q,Sun B,Chen J,Zhen Y,Jiang Y,Yang S(2021)用于CRISPR-CAS9辅助基因组编辑的改进的PCAS / PTargetf系统大肠杆菌。Acta Biochimica et Biophysica Sinica。https://doi.org/10.1093/abbs/gmab036

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