克服AAV尺寸限制CRISPR交付

由玛丽传动装置

玛丽传动

CRISPR和AAV:他们一起统治研究!

最初发布于2015年7月14日和最后更新的9月16日,2020年由Beth Kenkel。

CRISPR Genome编辑已迅速成为一种流行的系统体外和种系基因组编辑,但体内基因编辑方法受Cas9交付问题的限制。adeno相关的病毒载体(aav)伟德BV下载通常用于体内由于它们的低免疫原性和血清型范围而允许优先感染某些组织,因此基因递送。但是,包装链球菌Pyogenes(SPCAS9)和将GRNA(〜4.2 kB)进入AAV载体是由于其AAV的包装能力(〜4.7 kB)的包装能力而挑战。虽然这种方法已被证明是可行的,但它为额外的监管要素留下了一小圈。冯张的小组以前打包的CAS9和多个GRNA分成单独的AAV载体,增加了整体包装能力,但需要净化和两个AAV的共感染。

Cas9 Orthologs:更短,但就像有效和具体?

上述两个AAV策略显示了成功的目标修改,表明AAV是CAS9的良好送货车。然而,为了允许更多的监管序列空间,同时仍然拟合Cas9及其GRNA进入一个AAV,必须使CAS9变小。以前尝试“缩小”CAS9包括使用ST1CAS9(〜3.3 kB)嗜热链球菌和一个理性设计的截断的Cas9。遗憾的是,某些缺点限制了这些系统的效用:ST1CAS9需要一个非常特定的PAM序列,限制可定位基因座的数量,并且截短的CAS9的效率远低于其野生型对应物。

寻找较小但同样有效的Cas9蛋白,Zhang Lab采取了不同的方法。他们分析超过600 Cas9 Orthologs并且发现它们可以分为两组:较长的直脑大约1350个氨基酸,包括SPCAS9,速度显示大约1000个氨基酸。从较短的orthologs池中,只有金黄色葡萄球菌Cas9(SacAs9,1053氨基酸)显示哺乳动物细胞的切割活性。SACAS9以类似的效率为SPCAS9制作了Idels,导致小组将其努力集中在SACAS9表征上体内学习。

CRISPR / CAS9基因组编辑的陷阱之一是潜力偏离目标效果。为了比较SPCAS9和SACAS9的偏离目标效果,张的集团使用了一种叫做祝福的方法(直接原位打破标记,富集链霉抗生物素蛋白和下一代测序)。使用这种敏感方法,他们发现SACAS9没有显示比SPCAS9更高的偏离目标活动,确认其适用性体内学习。

测试AAV-SACAS9体内

测试AAV-SACAS9的效率体内,张实验室使用肝脏特异性血清型AAV8创建了一体化SACA9和SGRNA构建体。由于CRISPR / CAS9基因组的效率在靶向上变化,因此它们在小鼠中测试了两种基因。对于这两个基因,它们早在注射后1周看到indel形成和表型变化。与对照AAV-GFP相比,来自这些小鼠的肝脏是组织学上正常的,并且肝损伤标记没有增加。不仅AAV-SACAS9-SGRNA构建介导的基因组改性,而且它们在没有大量的免疫应答或毒性的情况下。

更多基于AAV的CRISPR系统

较小的CAS蛋白

SACAS9不是唯一足以包装成AAV的CRISP酶。

分裂AAV方法

在寻找较小的Cas9 Orthologs的作品时,它不会消除提供更大货物的必要性基础编辑器素质编辑器。在使用AAV提供大型转基因时可能看起来令人生畏,实际上是一个挑战,该领域已经克服了分裂aavs.。一般拆分Aavs在两件中打破了一个大型转基因,并将每件包装成单个AAV。当通过AAVs转导细胞时,重构全长基因和/或蛋白质。

重组像Cas9等分裂蛋白的一种方法是使用分裂的内序。分裂内胞是一对天然存在的多肽,当在两种蛋白质的末端时,介导蛋白质转浆化,类似于前mRNA剪接中的内含子。2016年,Fee等人与全长SPCAS9相比,开发了一个概念拆分Intein SPCAS9,其在HEK-293T细胞中具有适度的编辑率。2016年,chew等人。开发A.拆分Intein SPCAS9-AAV工具箱保留全长SPCAS9的基因靶向能力。这组质粒包括AAV-CAS9C-VPR用于靶向基因激活。分裂内嵌也已被用于表达基础编辑器。

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参考

Chew Wl,Tabebordbar M,Cheng JKW,Mali P,Wu Ey,NG Ahm,Zhu K,Wagers AJ,Church Gm(2016)多功能AAV-CRISPR-CAS9及其主机响应。NAT方法13:868-874。https://doi.org/10.1038/nmeth.3993

Cong L,Ran Fa,Cox D,Lin S,Barretto R,Habib N,HSU PD,Wu X,Jiang W,Marraffini La,Zhangfiny La,使用CRISPR / CAS系统的多重基因组工程。科学339:819-823。https://doi.org/10.1126/science.1231143

Cox DBT,Gootenberg JS,Abudayyeh Oo,Franklin B,Kellner MJ,Joung J,Zhang F(2017)RNA编辑Crispr-Cas13。科学358:1019-1027。https://doi.org/10.1126/science.AQ0180

精细ej,appleton cm,白色de,棕色mt,deshmukh h,kemp ml,bao g(2015)逆剪接Cas9允许使用紧凑的表达盒在人体细胞中切割Hbb和Ccr5基因。SCI REP 5:。https://doi.org/10.1038/srep10777

Garneau Je,Dupuis M-è,Villion M,Romero da,Barrangou R,Boyaval P,Fremaux C,Horvath P,Magadán啊,Moineau S(2010)Crispr / Cas细菌免疫系统切割噬菌体和质粒DNA。自然468:67-71。https://doi.org/10.1038/nature09523

Ibraheim R,Song C-Q,Mir A,Amrani N,Xue W,Sontheimer EJ(2018)在体内Neisseria Meningitidis Cas9的一体化腺相关病毒递送和基因组编辑。基因组BIOL 19:。https://doi.org/10.1186/s13059-018-1515-0.

Kim E, Koo T, Park SW, Kim D, Kim K, Cho H-Y, Song DW, Lee KJ, Jung MH, Kim S, Kim JH, Kim JH, Kim J-S (2017) In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nat Commun 8: .https://doi.org/10.1038/ncomms14500

Levy JM, Yeh W-H, Pendse N, Davis JR, Hennessey E, Butcher R, Koblan LW, Comander J, Liu Q, Liu DR (2020) Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nat Biomed Eng 4:97–110 .https://doi.org/10.1038/s41551-019-0501-5

Liu J-J, Orlova N, Oakes BL, Ma E, Spinner HB, Baney KLM, Chuck J, Tan D, Knott GJ, Harrington LB, Al-Shayeb B, Wagner A, Brötzmann J, Staahl BT, Taylor KL, Desmarais J, Nogales E, Doudna JA (2019) CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors. Nature 566:218–223 .https://doi.org/10.1038/s41586-019-0908-x.

Nishimasu H,RAN FA,HSU PD,Konermann S,Shehata Si,Dohmae N,Ishitani R,Zhang F,Nureki O(2014)Cas9中的Cas9晶体结构与引导RNA和靶DNA复合物。电池156:935-949。https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.02.001

RAN FA,CONG L,YAN WX,SCOTT DA,GOOTENBERG JS,Kriz AJ,Zetsche B,Shalem O,Wu X,Makarova Ks,Koonin Ev,Sharp Pa,Zhang F(2015)使用金黄色葡萄球菌Cas9的体内基因组编辑。自然520:186-191。https://doi.org/10.1038/nature14299

SenísE,Fatouros C,GroßeS,Wiedtke E,Niopek D,Mueller A-K,BörnerK,Grimm D(2014)Crispr / Cas9介导的基因组工程:adeno相关病毒(AAV)矢量工具箱。生物技术杂志9:1402-1412。https://doi.org/10.1002/biot.201400046.

Strecker J,Jones S,Koopal B,Schmid-Burgk J,Zetsche B,Gao L,Makarova Ks,Koonin Ev,Zhang F(2019)Crispr-Cas12B工程为人类基因组编辑。NAT Communic 10:。https://doi.org/10.1038/s41467-018-08224-4

Swiech L,Heidenreich M,Banerjee A,Habib N,Li Y,Trombetta J,Sur M,Zhang F(2014)在使用CRISPR-CAS中的哺乳动物脑中基因功能的体内询问。NAT Biotechnol 33:102-106。https://doi.org/10.1038/nbt.3055

王D,张F,高G(2020)基于Crispr的治疗基因组编辑:策略和AAV载体的体内递送。电池181:136-150。https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.023

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