一种新的基于AraC的光遗传学工具用蓝光控制基因表达

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“再见,L-arabinose drive
把你的文化放在摇瓶里
打开led灯
如果你想的话
你可以把它们关掉
不需要任何洗涤
不用洗了……”
——芭芭拉·迪·文图拉

如果您在Twitter上遵循Barbara di Ventura,您可能会看到她唱歌的视频关于她的实验室最近发表的论文Mustafa Khammash的实验室在苏黎世埃尔科希尔。“而不是一个图形摘要,这是一个音乐摘要,”弗赖堡大学教授Di Ventura说。本文是关于一个名为刀片的新工具(大肠杆菌中的蓝色光诱导arac二聚体),用蓝光转动表达式和关闭。

原始的AraC转录调控因子

他们的系统是基于控制从P坏的启动子。“AraC广泛应用于合成生物学、生物技术和几乎每个微生物实验室,”Di Ventura说。它依赖于阿拉伯糖通过引起AraC二聚体的构象变化来激活转录。在此过程中,二聚体从抑制转录变为激活转录。然而,该系统缺乏时空调控,难度大反过来,使它不适合某些类型的实验。

(想了解更多关于AraC和其他启动器系统的信息,请访问我们的质粒101:诱导启动子文章.)

修改Arac创建刀片

研究小组用VVD取代AraC的二聚结构域,创建了BLADE, VVD是一个光响应结构域,暴露在蓝光下会二聚(图1)。另一个蓝光诱导二聚结构域,Vaucheria frigidaaureochrome1 (vfa1),导致功能的BLADE变体,也。该团队使用P下游的mCherry报告基因测试了VVD和AraC dna结合域之间的不同连接坏的启动子。虽然没有一个构造具有与野生型ATAC一样强的信号,但它仍然达到大多数应用所需的表达水平。

蓝光诱导叶片二聚,激活转录。
图1:在蓝光照射下,BLADE的VVD域二聚并激活转录。

该团队创建了两个建筑,其中包括:

  • pBLADE-mCherry:这个结构,由pBAD33骨干,包含BLADE,即P坏的启动子,以及P下游的mCherry报告子坏的启动子。要用你的目标基因来使用这个质粒,你需要用你的目标基因来取代mCherry。
  • pBLADE只有:本质粒仅含有BLADE,并基于pTRC99a质粒.它不包括p坏的启动子。如果您已经有一个基于PBAD33的质粒表达您的感兴趣的基因,您所要做的就是合作转换PBLADE只有这样,先前克隆的基因,在pBAD启动子下,不需要任何克隆就可以用光来控制。

找到pBLADE-mCherry和pBLADE_ONLY在Addgene!

比起AraC, BLADE有什么优势?

与原始ARAC系统相比,刀片简直更精确。“我们展示了人口中的异质性较小,你可以做所有这些更空间狭窄的实验,以及那些需要与ATAC无法做到的可逆性的实验,”Di Ventura说。

刀片随着灯开关的轻弹激活转录,并尽快关闭。使用阿拉伯糖的原始ARAC系统需要许多洗涤步骤来删除阿拉伯糖,使得难以迅速调节。

Arabinose还在生长媒体内循环,不能包含在特定区域。然而,蓝光在空间上被限制,您可以通过团队创建的生活图像(图2)看到这展示了这一点。这些图像基于概念bacteriographs大约十年前创造的。为了生成这些图像,科学家们使用了表达超级文件夹GFP的pBLADE转化的菌株,而不是P坏的启动子。它们在琼脂平板上产生了一种细菌草坪,将掩模放在包含图像图案的板上,并在板上闪烁蓝光。由掩模阻断的板上的区域不会产生荧光蛋白,而暴露的区域将发出荧光。通过这些图像,您可以看到激活是如何精确的空间精确。

米开朗基罗《创造亚当》的细菌记录。
图2:米开朗基罗《创造亚当》的细菌图。这幅细菌图是用160张图片拼接而成的。从图片Romano等人,2021年与许可。

刀片只是Di Ventura的实验室和Khammash的实验室已经创建和共享了Zhammash的实验室之一。您可以找到沉积在Di Ventura的实验室的所有质粒,包括流行的轻型诱导核出口系统(词汇)这里.khamash实验室的光遗传质粒也可以找到这里


引用和资源

参考

Romano E, Baumschlager A, Akmeriç EB, Palanisamy N, Houmani M, Schmidt G, Öztürk MA, Ernst L, Khammash M, Di Ventura B(2021)工程使AraC对光响应,而不是阿拉伯糖。Nat化学杂志。https://doi.org/10.1038/s41589-021-00787-6

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