选择B(右)est荧光蛋白的实用方法

客人的博客

这篇文章是由阿姆斯特丹大学分子细胞学和Van Leeuwenhoek高级显微镜中心的客座博主Joachim Goedhart和Marieke Mastop贡献的。

在你决定买哪辆车之前,有必要试开几辆候选车。在你买一台新的显微镜之前,最好先看一看(并透过)几种型号。在你开始一个新项目之前伟德2021足球欧洲杯买球平台,最好的建议是尝试一些有希望的变体,看看它们在下面的表现如何你的实验条件。这是值得花的时间,如果你做对了,可以成为你下一篇论文或论文的图1(部分)。这一系列的帖子解释了如何批判性地评估报告的荧光蛋白的性质,如何做荧光蛋白的头对头的比较,以及如何做出一个明智的决定,最好的荧光蛋白伟德2021足球欧洲杯买球平台你的应用程序。

为特定的应用选择最好的荧光蛋白似乎是一项艰巨的任务。目前有许多伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光蛋白可用,而且荧光蛋白的数量正在稳步增加。通常,荧光蛋白的选择是基于文献中发现的特性或在网站上总结荧光蛋白特性的表格数据。伟德2021足球欧洲杯买球平台为了做出最佳的选择,需要在相关条件下仔细检查荧光蛋白的性质。

荧光蛋白的性质通常只在少数条件下进行伟德2021足球欧洲杯买球平台检查,因为不可能检查所有可能的生物和设备的组合。因为荧光蛋白的性能强烈地依赖于生物系统和成像方法,所以我们建议您在最能模拟预期应用的条件下,基于小规模的头对头比较研究进行选择。本系列文章将讨论活细胞成像的三个关键特性:(i)亮度,(ii)耐光性(iii)聚合趋势。

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亮度

亮度是指荧光分子的荧光强度。较高的亮度增加了检测信号,因此高亮度是荧光团的一个重要特征。关键问题是如何最好地定义或确定亮度。在这里,我们将解释如何确定实用亮度和为什么实用亮度是一个更好的标准选择最亮的荧光蛋白理论亮度。

理论上的亮度

决定荧光团亮度的两个关键特性是激发光被吸收的程度和被吸收的光子转换为发射光子的效率。分别用消光系数(EC)和量子产额(QY)来表示。理论亮度的计算方法是将EC乘以QY (EC*QY,有时归一化为EGFP的值)。数值越高,理论亮度越高。理论亮度经常出现在表与荧光蛋白的性质,并提供了一个快速的方法来比较荧光蛋白,如见伟德2021足球欧洲杯买球平台Chudakov等人(2010),Cranfill等人(2016)刺(2017)。然而,理论亮度忽略了几个与成像策略和样品有关的重要实验条件。

实际的亮度

具有高内在亮度的蛋白质不能很好地折叠或不能在显微镜设置中检测到的实际亮度为零,是无用的。因此,在你的实验设置中,根据荧光蛋白的实际亮度进行比较是更加明智的。伟德2021足球欧洲杯买球平台实际亮度考虑到所有应用特定的参数,包括显微镜的规格(激发波长,可用的发射滤波器,探测器灵敏度)和生物系统(温度,原核生物与真核生物,背景荧光)。

确定实际的亮度

当一盘哺乳动物细胞暂时转染含有荧光蛋白(融合)在培养皿中,单个哺乳动物细胞的荧光强度变化很大。这是由细胞摄取质粒的随机性造成的。为了校正这种变异,一种等量表达的参考荧光蛋白(Goedhart等人,2011)可以使用。

一个分析在我们实验室开发的参考蛋白,从相同的开放阅读框架翻译和分离蛋白质的兴趣2裂解肽(Goedhart等人,2010)。对该试验的解释见图1。感兴趣的荧光蛋白和参考蛋白之间的严格相关性(Goedhart等人,2011)允许在真实的实验条件下精确测定细胞的亮度。通过测定一组荧光蛋白(具有相同参考蛋白)在相同条件下的亮度,可对实际亮度进行排序(伟德2021足球欧洲杯买球平台Goedhart等人,2012,宾德尔斯等人,2017年)。mTurquoise2与mVenus共同表达的质粒来自Addgene

以细胞为基础测定实际亮度

另一种避开哺乳动物细胞中观察到的细胞变异的方法是标记内源基因。通过对产生带有荧光蛋白标记的内源性蛋白质的细胞(或组织)进行成像,并对另一种荧光蛋白重复这一过程,可以得出实际亮度的排名。这种方法已在酵母中应用Lee等人(2013)在线虫中El Mouridi等人(2017)hepert等人(2016)。在哺乳动物细胞中,这是可能的CRISPR / Cas-based基因组编辑

选择荧光蛋白

两种橙色荧光蛋白的实际亮度分析所得数据伟德2021足球欧洲杯买球平台实用亮度考虑了所有的实验条件。其中,荧光蛋白在宿主细胞中的折叠和成熟效率是决定其实际亮度的关键因素。因此,实际亮度提供了比理论亮度更好的图片可以预期在“真实”应用。因此,在一个模拟未来应用的系统中,鉴别一些有前途的荧光蛋白并确定和比较它们的实际亮度是有意义的。伟德2021足球欧洲杯买球平台在图2中,我们提供了一个比较两个橙色荧光蛋白实际亮度的例子,只不同于一个氨基酸。伟德2021足球欧洲杯买球平台如果没有关于光稳定性或聚集倾向等性质的进一步信息,我们的选择将是mKOk-2A-mTq2;它比。亮得多mKO2-2A-mTq2根据这个数据。实用的亮度测定(使用共表达荧光蛋白或内源性标记基因)可用于验证不同成像条件(例如不同的发射滤光片)或不同设置下的伟德2021足球欧洲杯买球平台性能。

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非常感谢我们的客座博主Joachim Goedhard和Marieke Mastop!

约阿希姆Goedhart头像Joachim Goedhart是阿姆斯特丹大学分子细胞学和Van Leeuwenhoek高级显微镜中心的助理教授。他开发、表征和使用基因编码的荧光探针。你可以在twitter上关注他:@joachimgoedhart

Marieke Mastop头像Marieke Mastop是分子细胞学(阿姆斯特丹大学)的博士研究生,她在那里开发基于FRET基因编码的生物传感器。

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