Optimetics的底漆:介绍和OPSIN交付

客人的博客

这篇文章由客座博主Derek Simon贡献。

Optogenetics Logo Addgene.Optimetics.正在散布通过野火等神经科学群落,充分理由。For the first time in the history of neuroscience research we have a technology that allows us to show causality in neural circuits with incredible temporal and spatial precision (I’m not going to discuss the basic biology of optogenetics so if you are not familiar with it, check out the video below)。这并不是说这项技术没有它的局限性,或者其他技术需要被抛弃,但很明显,我们正处于一个神经科学研究的时代,光遗传学将成为几乎所有神经科学项目或感兴趣的主题中使用的标准工具。尽管它的力量和多用途,技术是引人注目的简单易学且相对便宜(与其他科学技术相比)。但光遗传学实验究竟是如何工作的呢?运行它所需的各种工具和组件是什么?最重要的是,在方法论和实验上的限制和考虑是什么?

我最近在Antonello Bonci的实验室里度过了两个月的董事国家药物滥用研究所内部研究计划(NIH-NIDA IRP),目标是学习行为光遗传学,以便在我的实验室实现这项技术洛克菲勒大学。在这个光遗传学入门系列的这篇文章和即将发布的文章中,我很高兴分享一些我从NIDA的许多科学家那里学到的技巧和技巧,以及一些你可能在光遗传学论文的材料和方法部分找不到的实用性和考虑。

光遗传学第一步:决定你想如何使用光遗传学

要考虑的最重要的问题是您想要使用Optimetics的究竟是什么?该技术是非微不足道的;您不想花几个月进行手术,并使光纤电缆仅挂钩您的激光器,而且没有适当的控制或适当的行为读数,允许您解释您的实验结果。与科学中的许多东西一样,光源最适合解决特定问题。Optogenetics是一种工具,就像科学家庞大的工具箱中的任何其他工具一样,它的有效性取决于它如何以及为何使用。

在光遗传学中有两个常用的主要实验途径(并不相互排斥):1)电生理学和2)行为实验。我不是一个生理学专家所以我不能直接说这个话题,但在众多的研究中,光遗传学中使用片生理学为了直接表明,例如,特定类型的神经元发射的一个特定的大脑区域会导致特定神经递质释放和突触后电流。幸运的是,如果你的实验室主要关注行为,你不必使用电生理学来证明你的光遗传操作正在产生动作电位(或者缺乏动作电位,这取决于你使用的视蛋白);光遗传学的功效已经被证实。因此,一个具体的、定义良好的、稳健的行为输出足以评估您的光遗传操作的有效性(尽管审稿人可能也会要求电生理学数据,但这是合作者的目的)。例如,如果你研究与上瘾有关的神经通路(比如我工作的实验室),有一个很明显的行为实验用来测试你对促进奖励感兴趣的回路的充盈性是一个自我刺激实验在这个实验中,老鼠启动的一个神经元回路的光遗传激活要么会导致奖励感,要么不会导致随后的重复刺激。另一方面,空间记忆任务不是一个合适的测试。当然,适当的控制是必需的,包括,例如,确认视蛋白在预定的大脑区域和/或细胞类型的表达(稍后我会详细讨论这一点)。

但是光遗传学实验的不同步骤是什么?每一步都需要什么工具?行为光遗传学可以大致分为三个主要步骤:

1)在你想要刺激的大脑区域选择和表达你的选择

2)使用光纤的制造和植入感兴趣区域

3)行为实验

我将讨论每个步骤的一些关键特性。今天我们将讨论你的视蛋白的选择和表达,但请关注未来几周关于下一步的文章。

光基因结构的表达

您所需的致敏构建体在脑区和细胞类型的感兴趣中的表达显然是对任何致敏实验的重要意义。有许多用于不同类型的OPSINS可用的变体,其他地方彻底讨论了它们的差异和用途(在这里在这里例如)[2],[3]。Karl Deisseroth.在斯坦福大学,开创了光源的关键科学家之一,遗传地操纵了许多OPSIN基因以改变激活的光谱和Opin活性/不活动的动力学。Deisseroth博士还慷慨地通过了各种大学的传染媒介核心以及Addgene。看到戴瑟罗斯实验室主页有关可用结构类型的详细信息,获取材料转让协议的说明,以及供应商名单(如北卡罗来纳大学的矢量核心),提供他的构念。重要的是,控制病毒(不表达视蛋白)也是可用的。

选择你的视蛋白

您必须考虑是否希望刺激或抑制神经元烧制,细胞型特异性,OPSIN变体的动力学以及最适合您的特定实验的其他特殊性。咨询这些评论,了解不同的变体[1,2,4]。而且,当然,了解许多不同OPSIN变体以及如何使用的最佳方式是咨​​询此时发表的许多主要研究文件。

Opsin表

简而言之,一些标准的视蛋白(见上表)包括ChannelRhodopsin2(CHR2),一种对蓝光敏感的非特异性阳离子通道,它的激活会导致去极化和随后的动作电位的触发。紫(人力资源)是绿光/黄光敏感氯离子泵,其激活导致氯离子流出,随后的超极化和抑制动作电位的产生。Archaerhodopsin (Arch)在与HR类似的光谱中被激活并且还导致膜超极化但与HR不同,通过氢离子流出来实现这一点;证据表明,拱门可能更有效地沉默神经元。

提供你的OPSIN.

标准的视蛋白输送方法是局部注射视蛋白腺相关病毒(AAV)使用立体定向手术构造(见下面的视频)。Deisseroth实验室已经开发了许多这种AAV构建物,其中包括各种启动子和其他基因操作,以帮助限制特定神经元亚型的表达。然而,用于AAV构建的启动子长度只有几个kb,因此仅通过启动子定向表达获得神经元特异性是非常有限的。因此,高表达的,一般的神经元启动子,如突触素或camKIIα驱动大多数的结构。作为一种替代方案,一些结构被设计为双流动逆开放阅读框架(DIO)。在coexpression与cre重组酶(从小鼠系或病毒共注射),视蛋白倒置到正确的方向和表达(在一个通用启动子的控制下)。DIO视蛋白允许依赖于cre重组酶启动子的细胞类型特异性,同时仍然利用AAV构建中启动子的强大表达。

立体定位手术

如上所述,AAV OPSIN构建体通过立体手术直接注射到利息区域(可以找到立体手术视频youtube[以上]j)。使用立体定向手术的AAV结构是一种神经科学研究技术,通常不仅仅用于光遗传学。成功的立体定向手术依赖于识别bregma和lambda缝合线,以及随后确定你感兴趣的大脑区域的适当坐标(如下图所示)。由于光遗传学的精确性主要依赖于AAV视蛋白结构的成功传递,因此立体定向手术的熟练程度是必需的。在任何光遗传学实验中,你可能需要将病毒注射到20只或更多的老鼠中,并且所有这些手术的注射必须几乎相同。通过啮齿动物脑地图集或研究论文确定坐标,并在使用病毒之前采用注射模具的方法。你可能需要根据你自己的方法来调整坐标,但是最好花时间练习你的注射,直到它们是准确的和可重复的。我也强烈建议花钱买一个高质量的立体画框,带数字读数。优点是你可以“零”你的坐标在bregma,这允许你快速和可靠地定位你的注射地点。我们最近才买的模型。关于病毒注射立体定向手术的附加通用方案可在这里找到[5,6]。

甾体外科设置。在通过耳杆固定到框架上的鼠标后,剃须头。然后技能在头皮中切开后暴露。用过氧化氢溶液清洁头皮有助于在头皮上可视化贫尔玛和λ缝合线。将一个孔钻入所需坐标的颅骨上。将注射器插入孔中,并注入病毒。
Opsin转基因小鼠

转基因小鼠系也被设计表达多种视蛋白基因[7-9]。使用这些品系的好处是,如果一个品系与表达特定cre的适当小鼠品系杂交,你的视蛋白的病毒表达就不再需要达到细胞类型的特异性视蛋白表达。然而,你能够使用的视蛋白的类型显然受到了鼠标线本身的限制。鼠系的生成、繁殖和维护也是一项昂贵而耗时的工作。最后,视蛋白在小鼠体内的表达可能低于病毒的表达,但仍足以成功刺激。

测试视蛋白表达

不管你的视蛋白基因的表达方式是什么,检测你的视蛋白的表达是至关重要的。幸运的是,戴瑟罗斯构建了共同表达a荧光蛋白,便于识别视蛋白的表达,病毒的扩散程度,并具有共定位免疫荧光,细胞类型特异性。只表达荧光蛋白的病毒被用作关键控制。伟德2021足球欧洲杯买球平台

根据AAV血清型、选择的启动子和靶脑区域的大小,最佳的病毒滴度必须通过经验来确定(这是任何病毒注射到大脑的情况)。一般的经验法则是,如果你能检测到强荧光信号(没有抗体操纵),那么表达可能足以成功的光刺激。值得注意的是,一些启动子非常强大,如果让它们长时间表达,可能会导致神经元死亡(突触蛋白私下告诉我,它是这些高度表达的启动子之一)。进行时间过程实验,监测不同时间点的表达(例如,在8周内每1-2周一次),以确定病毒注射和行为实验开始之间的最佳时间段。

你是否尝试刺激细胞体或轴突末端也会影响你可能需要让病毒表达的时间长度。例如,如果你注射到腹侧被盖区(VTA),但希望刺激伏隔核(NAc;作为VTA投射的主要目标),你必须等待视蛋白表达并被动地扩散到纤维的长度,然后才可以尝试刺激终末[10]。不幸的是,视蛋白不是主动运输的,必须被动扩散,因此,视蛋白可能需要长达6-8周的时间才能到达轴突末端。同样,这必须在你自己的系统中根据经验来决定。

一旦你有信心,你已经优化了立体涛手术和病毒表达,您已准备好进入MementOrmetics的材料科学部分。在下周的帖子中,我们将深入研究一些重要的材料科学考虑因素的视科医生实验。敬请关注!


非常感谢我们的嘉宾博主Derek Simon!

德里克·p·西蒙

德里克。P。西蒙他在密歇根大学获得细胞和分子生物学博士学位,目前是洛克菲勒大学Mary Jeanne Kreek实验室的博士后研究员。他的兴趣包括学习和记忆在阿片类成瘾和科学传播/科学写作中的作用。德里克。也是钢琴家和有抱负的作曲家。看他的博客drsimonsaysscience.org或者在推特上关注他@derekpsimonphd.

参考文献

1.动物模型中神经回路的光遗传学研究。《神经科学》2012;13(4):251-66。doi: 10.1038 / nrn3171。PMID:22430017

2.Fenno L等。光遗传学的发展与应用。神经科学年度回顾。2011; 34:389 - 412。doi: 10.1146 / annurev -神经- 061010 - 113817。PMID:21692661

3.伯恩斯坦JG,博伊登ES。光遗传学工具用于分析行为的神经回路。认知科学的趋势。2011; 15(12): 592 - 600。doi: 10.1016 / j.tics.2011.10.003。PMID: 22055387;PMCID: PMC3225502

4.Mattis J等。应用微生物视蛋白直接比较分析的光遗传学工具的原理。自然的方法。2012; 9(2): 159 - 72。doi: 10.1038 / nmeth.1808。PMID: 22179551;PMCID: PMC4165888

5.Harris JA等。用荧光蛋白在非转基因和cre驱动小伟德BV下载鼠中顺行轴突示踪的腺相关病毒载体伟德2021足球欧洲杯买球平台神经科学/编委会目前的协议,Jacqueline N Crawley[等]。2012;第一章:第一单元201 -18。ns0120s59 doi: 10.1002/0471142301.。PMID: 22470147

6.Gore BB等。利用组合病毒方法操纵投射特异性神经元群体中的基因表达。神经科学/编委会目前的协议,Jacqueline N Crawley[等]。2013;4(435):4 35 1-4 20。ns0435s65 doi: 10.1002/0471142301.。PMID:25429312;PMCID: PMC4242517

7. Madisen L等人。用于光诱导的激活和沉默的CRE依赖性致敏转基因小鼠的工具箱。自然神经科学。2012; 15(5):793-802。DOI:10.1038 / NN.3078。PMID: 22446880;PMCID: PMC3337962

8.Zhao S,等。细胞类型特异性通道紫质-2转基因小鼠的神经回路功能的光遗传解剖。自然的方法。2011; 8(9): 745 - 52。PMID: 21985008;PMCID: PMC3191888

9.关键词:光遗传学,小鼠,转基因,生物信息学大脑研究的进展。2012; 196:193 - 213。doi: 10.1016 / b978 - 0 - 444 - 59426 - 6.00010 - 0。PMID: 22341327;PMCID: PMC3433654

10. van zessen r等。VTA GABA神经元的激活扰乱了奖励消费。神经元。2012; 73(6):1184-94。DOI:10.1016 / J.NEURON.2012.02.016。PMID: 22445345;PMCID:PMC3314244

资源Addgene

在Addgene找到光遗传学质粒

主题:Optimetics.,伟德BV下载,AAV

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