AAV:一种用于哺乳动物基因表达的多功能病毒工具

由Guest Blogger.

本文由客座博客Didem Goz Ayturk撰稿,Didem Goz Ayturk是哈佛医学院Connie Cepko实验室的博士后研究员,Addgenie Karen Guerin编辑。

腺相关病毒(AAV)已成为研究和临床应用的最喜欢的病毒工具。AAV可用于瞬时表达各种细胞类型的感兴趣的基因。它是大约50年前描述的作为腺病毒制剂的污染物,因此名称(艾奇逊等人,1965年) AAV是一种单链DNA病毒,属于细小病毒科。它有一个包装在二十面体衣壳中的“简单”基因组。它没有脂质涂层,也称为包膜,因此不能支持糖蛋白的添加,如VSV-G,到其表面。在研究应用中,基因组通常被掏空,以便为基因传递和安全打开宝贵的空间。在组织培养环境中,通过提供编码复制酶功能和衣壳蛋白的基因,你可以很容易地对病毒进行补充,换句话说,“反式”补充。这使研究人员能够在可控的环境下产生更多的病毒。尽管AAV从广泛的生物体中分离出来,但它尚未与疾病相关,而且它被认为是一种生物安全一级(BSL1)病毒因子。

下载病毒vectors 1伟德BV下载01电子书

完美重组AAV (rAAV)工具的四个考虑因素

AAV可以被广泛应用,包括特定细胞类型的瞬时基因表达,CRISPR基因组编辑,光遗传学,chemogenetics实验。如果你刚开始使用raav作为基因传递工具,以下是你在开始之前应该考虑的一些事情:

1.货物的能力

即使是掏空版本的rAAV也有~ 4.7 kb的承载能力,这是病毒基因传递的关键限制之一。然而,如果你感兴趣的基因足够小,你可以设计包含两个基因的单一rAAV载体,并使用诸如IRES或2a,从一个启动子中共同表达它们。如果滴度高,不同raav的合并感染率也相当高,所以如果你不能将你的两个基因都放入一个载体中,你可以合并感染(尽管这可能不是总是有效的体内)。

2.特异性

有几种不同的rAAv组件可以在特定细胞/组织中驱动基因表达;这些包括启动子,flp或Cre依赖性基因交换机和血清型(血清型将在下面讨论)。如果您的目标是广泛的表达,宽敞的促进者,如CAG(鸡饼型肌动蛋白启动子与CMV即时早期增强剂)是一个不错的选择。如果您有特定的目标单元格类型,则可能需要尝试不同的推动者,例如,CAMK2A用于神经元特异性。另一方面,具有CRE-或翻盖依赖性基因表达的rAAV载体可以用CRE或FLP注射到具有特定细胞类型中的CRE或FLP的动物,导致这些细胞中的基因表达。

3.血清型

衣壳蛋白是rAAV载体的重要组成部分,是rAAV载体生物学的驱动因素。尽管多项研究表明,不同的血清型感染不同细胞类型的能力不同,但最近的一项研究表明,大多数(或所有)血清型使用相同的受体(AAVR) (皮莱等人,2016年)。观察到的向性可能是由于其他因素,如病毒粒子附着在细胞表面,或可能是进入后的步骤,如脱壳。

AAV的命名可能会令人困惑。你可能会看到像AAV2/2或AAV2/8这样的名称,但是这些数字到底意味着什么呢?第一个数字表示反向终端重复(ITR)类型。itr是AAV基因组侧面的短DNA序列,允许它在宿主细胞中形成串联体。它们和Rep蛋白一起,促进了人类基因组19号染色体上的AAVS1位点的整合,这一点只在野生型AAV中观察到,而不是载体形式。几乎所有的向量都包含2型itr。2型itr可以与多种衣壳类型打包。用于包装rAAV载体的衣壳类型,即血清型-用第二个数字表示。例如,如果rAAV载体的ITR为2型,衣壳为8型,则表示为AAV 2/8。

4.基因组

野生型AAV是单链DNA病毒。在未涂覆DNA之后,病毒依赖于宿主细胞复制机械以合成互补DNA链。该步骤被认为是RAAV的转导效率的限制因素。克服这一点,(麦卡蒂等,2001年)通过突变其中一个ITRS来设计一个二聚体或自互补的AAV(称为SCAAV)。SCAAV向量显示比SSAAV快速发作(天)和更高级别的转换表达。然而,它们的包装能力(<2.5KB)是SSAAV(<4.8KB)的一半,限制可以成功包装的基因数和监管元素的数量。

如果需要快速的转基因表达,caav可能是有价值的。较低的效价可以达到所需的转基因表达水平,减少由于高病毒粒子浓度而出现毒性或免疫原性的机会。

快速边注:您可以使用逆行装甲防护绘制神经元连接。

需要病毒吗?检查Addgene的病毒式服务!

ssAAV和caav基因组的比较

生产你rAAV

全国各地设施,您可以获得优质的质量,高滴度raav(包括addgene!),但你也可以在自己的实验室里用标准的分子生物学工具和组织培养经验生成raav。

简而言之,您首先通过携带感兴趣的基因的RAAV载体来转发HEK293T细胞,腺病毒辅助质粒和含有质粒的批量和帽(图2,通常称为“三重质粒转染”)。2-3天后,收集上清液,(或在某些情况下,将细胞提取物制成细胞提取物,因为一些RAAV血清型被释放到培养基中,而其他rAAv血清型在其他人不是)(Vandenberghe等人,2010)用PEG沉淀病毒粒子。然后用高速超离心机通过密度梯度离心进一步纯化病毒粒子。病毒粒子会形成一个带由于它们的高密度,你可以从梯度收集这个带。然后通过透析/缓冲液交换去除密度梯度物质,如果需要可以进一步浓缩病毒粒子。

使用靶向病毒基因组的引物和/或蛋白质凝胶可以通过QPCR滴定病毒赛准备。和/或蛋白质凝胶(Veldwijk等人,2002)。这些滴度是针对物理粒子的,其中很多是没有传染性的。物理粒子和感染粒子的比例可以变化很大,从1到>100。

AAV病毒粒子非常稳定。它们可以经受冻融循环和脱水,这使得之前可能在你的长凳上、离心机里或孵化器里的准备物污染成为可能。为了减少这种情况,您应该用消毒剂处理所有与AAV接触的一次性物品和表面,例如Coverage Plus NPD。也很重要的是努力应用常见的细胞培养方法。

rAAV生产示意图

在活的有机体内rAAV交付

AAV交付有几个因素体内这取决于你的生物系统。这些因素在很大程度上影响你感染的成功率。无论你的申请是什么,下面列出的一些参数是你在继续注射之前需要考虑的:

注入效价

可以输送到组织中的病毒颗粒的数量取决于病毒制剂的滴度和可以输送的最大体积,这是非常重要的。不幸的是,如上所述,物理粒子的滴度不能直接转化为你将观察到的东西体内尽管这是一个起点。你可以从查阅有关特定组织的文献来寻求建议,但通常情况下,最佳剂量需要根据经验来确定体内通过尝试一系列稀释。

animal

首先,重要的是要记住,最终分化细胞(即有丝分裂后细胞)将有长期的AAV表达,但在分裂细胞中,表达将丢失。被注射动物的年龄将决定你能成功感染哪种细胞。(即在发育早期,尚未出生的细胞,即使存在有丝分裂祖细胞,也不会被AAV感染)(熊和Cepko, 2016)

可视化感染

在开始分娩前,你还应该考虑如何可视化你的rAAV感染。你有没有在rAAV结构中加入报告基因,比如绿色荧光蛋白或mCherry吗?这将很容易通过荧光测量直接观察表达发生的位置。如果不是,你可以考虑共注射一个在相同启动子下携带报告基因的AAV,驱动你想要的基因,并测量报告基因的表达作为你想要的基因的代理,这可能不容易检测。如果不可能共表达或共感染,用免疫组化或现场杂交可能是你最好的选择。

感染后的时间

足够量的时间需要通过注射和组织处理以检测AAV介导的基因表达。定时将高度依赖于衣壳类型和您感染的组织。等待〜2周是许多组织的良好起点。据报道,AAV介导的基因表达是非常稳定的,持续在人类临床试验和狗的几年(Wonjo等人,2013)。

准备AAV时的考虑因素:

在设计和增长之前 交货及之后
货物能力 管理滴度/体积
推广者(具体vs广泛) 动物时代
血清型-组织/细胞向性 感染的可视化
生产(DIY还是购买?) 感染后的时间

AAV是一种极其多功能的病毒基因递送工具。您特定研究应用的需求将确定AAV设计和交付的适当参数。虽然您的最终血清型/滴度/年龄确定将大量依赖试点实验,但您可以向不断增长的文献中寻找适合许多不同生物系统的设计建议。在过去二十年中,涉及AAV的一百多个临床试验,似乎在未来几年内,此工具将在治疗和基本研究环境中仍然受欢迎。


非常感谢我们的博客,Didem Goz Ayturk!

Didem沙丘状积砂AyturkDidem Goz Ayturk是Connie Cepko实验室的博士后研究员,利用病毒工具研究视网膜的神经元回路。

参考文献

1.艾奇逊、罗伯特·W·布鲁斯·c·卡斯托和威廉·麦克德·哈蒙。腺病毒相关缺陷病毒颗粒科学149.3685(1965): 754 - 755。PubMedPMID:14325163

2.Pillay,S.等人。“腺相关病毒感染的基本受体。”自然4:520(7588):108-12(2016)。PubMedPMID: 26814968

3.麦卡蒂,D. M.,保罗E.莫纳汉,理查德J.萨穆斯基。“自我互补重组腺相关病毒(caav)载体可促进有效的转导,而不依赖于DNA合成。”基因治疗8.16(2001)。PubMedPMID: 11509958

4. Vandenberghe,Luk H.等。“在腺相关病毒制造期间”高效血清型依赖性释放功能载体中的培养基。“人类基因治疗21.10(2010):1251-1257。PubMedPMID:20649475.。公共医学中心PMCID: PMC2957237

5. Veldwijk,Marlon R.等人。“基于实时定量PCR的滴定法的开发与优化AAV-2股票滴定”。分子治疗6.2(​​2002):272PMID: 12349826

6.熊文军,康斯坦斯·塞普科。在两个不同年龄的新生小鼠视网膜下注射的具有广泛活性启动子的AAV8载体的不同表达模式。视网膜退行性疾病。Springer International Publishing,2016. 501-507。PubMedPMID: 26427452

7。冈田克也、隆。高效的AAV载体生产系统:杜氏肌营养不良的基因治疗。Intech Open Access Publisher,2013。Intech网页

8.Wojno, Adam P, Eric A. Pierce和Jean Bennett。“看到了光。”科学转化医学5.175 (2013): 175 fs8 - 175 fs8。PubMedPMID: 23467559

Addgene博客上的资源伟德体育中心

在Addgene.org上的资源

主题:伟德BV下载,AAV

留下你的评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅