AAV:哺乳动物中基因表达的多功能病毒工具

客人的博客

本文由客座博客Didem Goz Ayturk撰稿,Didem Goz Ayturk是哈佛医学院Connie Cepko实验室的博士后研究员,Addgenie Karen Guerin编辑。

adeno相关病毒(aav)已经成为研究和临床应用中最受欢迎的病毒工具。AAV可以在多种细胞类型中瞬时表达一个感兴趣的基因。大约50年前,它首次被描述为腺病毒制剂的污染物,因此得名(艾奇逊等人,1965年)AAV是一个单链,属于Parvoviridae的DNA病毒。它具有包装在icosaheDral衣壳的“简单”基因组。它没有脂质涂层,也称为包膜,因此不能支持将糖蛋白(例如Vsv-G)加入其表面。在研究应用中,基因组通常被扼流,使得珍贵的货物空间用于基因递送和安全性。您可以通过提供编码复制酶活性和衣壳蛋白的基因,轻松地在组织培养环境中补充组织培养环境中的病毒。这使研究人员能够在受控设置中产生更多病毒。尽管AAV与广泛的生物分离,但它尚未与疾病有关,并且认为它被认为是生物安全1(BSL1)病毒剂。

下载病毒载体101电子书伟德BV下载

完美重组AAV(RAAV)工具的四种考虑因素

AAV可以用于各种应用,包括特定细胞类型中的瞬时基因表达,CRISPR基因组编辑Optimetics.,chemogenetics实验。如果你刚开始使用raav作为基因传递工具,以下是你在开始之前应该考虑的一些事情:

1.货物的能力

即使是掏空版本的rAAV也有~ 4.7 kb的承载能力,这是病毒基因传递的关键限制之一。然而,如果你感兴趣的基因足够小,你可以设计包含两个基因的单一rAAV载体,并使用诸如忿怒或2,从一个启动子中共同表达它们。如果滴度高,不同raav的合并感染率也相当高,所以如果你不能将你的两个基因都放入一个载体中,你可以合并感染(尽管这可能不是总是有效的在活的有机体内)。

2.特异性

有几种不同的rAAV成分可以驱动特定细胞/组织中的基因表达;其中包括启动子、隔爆或Cre依赖基因开关,以及血清型(血清型将在下面进一步讨论)。如果你的目标是广泛表达,一个广泛活跃的启动子,如CAG(鸡β肌动蛋白启动子与巨细胞病毒立即早期增强子),是一个很好的选择。如果你有一个特定的靶细胞类型,你可能想尝试不同的启动子,例如Camk2a作为神经元特异性的启动子。另一方面,具有Cre-或flip依赖基因表达的rAAV载体可以注射到具有特定细胞类型表达的Cre或Flp的动物体内,从而只在这些细胞中产生基因表达。

3.血清型

衣壳蛋白是rAAV载体的重要组成部分,是rAAV载体生物学的驱动因素。尽管多项研究表明,不同的血清型感染不同细胞类型的能力不同,但最近的一项研究表明,大多数(或所有)血清型使用相同的受体(AAVR) (Pillay等人。,2016年)。观察到的向性可能是由于其他因素,如病毒粒子附着在细胞表面,或可能是进入后的步骤,如脱壳。

AAV的命名可能会令人困惑。你可能会看到像AAV2/2或AAV2/8这样的名称,但是这些数字到底意味着什么呢?第一个数字表示反向终端重复(ITR)类型。itr是AAV基因组侧面的短DNA序列,允许它在宿主细胞中形成串联体。它们和Rep蛋白一起,促进了人类基因组19号染色体上的AAVS1位点的整合,这一点只在野生型AAV中观察到,而不是载体形式。几乎所有的向量都包含2型itr。2型itr可以与多种衣壳类型打包。用于包装rAAV载体的衣壳类型,即血清型-用第二个数字表示。例如,如果rAAV载体的ITR为2型,衣壳为8型,则表示为AAV 2/8。

4.基因组

野生型AAV是单链DNA病毒。在DNA脱壳后,病毒依靠宿主细胞的复制机制合成互补DNA链。这一步骤被认为是影响rAAV转导效率的一个限制因素。为了克服这一点,(McCarty等人。,2001)通过突变其中一个itr,设计出一个二聚体,或自我互补的AAV(称为scAAV)。与ssAAV相比,caav载体具有快速发病(天)和更高水平的转基因表达。然而,它们的包装能力(<2.5Kb)是ssAAV (<4.8Kb)的一半,限制了能够成功包装的基因和调控元件的数量。

如果您需要快速转基因表达,SCAAV可能是有价值的。较低滴度可能能够实现所需的转基因表达水平,最小化由于高病毒素浓度而导致毒性或免疫原性的机会。

快速边注:您可以使用逆行AAV绘制神经元连接。

需要病毒吗?检查Addgene的病毒式服务!

SSAAV和SCAAV基因组的比较

生产你rAAV

全国有几家机构可以提供高质量,高滴度的rAAV (包括Addgene !),但你也可以在自己的实验室里用标准的分子生物学工具和组织培养经验生成raav。

简单地说,首先用携带你感兴趣的基因的rAAV载体、一个腺病毒辅助质粒和一个含有Rep和Cap的质粒转染HEK293T细胞(图2,通常称为“三重质粒转染”)。2-3天后,收集上清液(或在某些情况下制成细胞提取物,因为一些rAAV血清型被释放到培养基中,而另一些则没有)(Vandenberghe等人。,2010)使用佩格斯沉淀病毒群岛。然后,使用高速超速离心机进一步通过密度梯度离心净化病毒粒子。由于它们的高密度,病毒群体将形成带的频带,并且您可以从梯度收集此频带。然后,通过透析/缓冲液交换去除密度梯度材料,如果需要,可以进一步浓缩病毒群。

利用针对病毒基因组的引物和/或蛋白凝胶,qPCR可以滴度病毒粒子制备物veldwijk等。,2002年)。这些滴度是针对物理粒子的,其中很多是没有传染性的。物理粒子和感染粒子的比例可以变化很大,从1到>100。

AAV病毒群岛非常稳定。它们将承受冻融循环和脱水,这使得从以前的准备污染可能位于您的替补席上,即在离心机或孵化器中。为了最小化这一点,您应该处理与AAV接触的所有一次性物品和表面,例如覆盖加上NPD。同样非常重要的是勤勉地应用普通细胞文化实践。

rav生产原理图

在活的有机体内rav交付

有几个因素涉及到AAV的交付在活的有机体内根据您的生物系统而变化。这些因素极大地影响了感染的成功水平。无论您的应用程序可能是什么,下面列出了一些您可能希望在继续注射之前考虑的一些参数:

注射滴度

您可以递送到组织的病毒颗粒的数量将由您的病毒准备滴度和可以传递的最大体积确定,并且具有重要意义。遗憾的是,如上所述,物理粒子的滴度不能直接翻译成你所观察到的东西在活的有机体内,虽然这是一个起点。您可以首先在特定组织上进行建议来开始文献,但是,通常,需要经验确定最佳剂量在活的有机体内通过尝试一系列稀释。

动物时代

首先,重要的是要记住,终端分化的细胞(即后蛋白细胞)将具有长期AAV表达,但在分割细胞中,表达将丢失。注射的动物的年龄将确定您可以成功感染的细胞类型。(即在早期发育时间点,即使存在有丝分裂祖细胞,尚未出生的细胞也不能被AAV感染)(熊和贝科霍,2016年

感染的可视化

在开始分娩前,你还应该考虑如何可视化你的rAAV感染。你有没有在rAAV结构中加入报告基因,比如GFP或MCHERRY.吗?这将很容易通过荧光测量直接观察表达发生的位置。如果不是,你可以考虑共注射一个在相同启动子下携带报告基因的AAV,驱动你想要的基因,并测量报告基因的表达作为你想要的基因的代理,这可能不容易检测。如果不可能共表达或共感染,用免疫组化或原位杂化可能是最好的选择。

感染后的时间

在注射和组织加工之间需要足够的时间来检测aav介导的基因表达。时间高度取决于衣壳类型和你感染的组织。对许多组织来说,等待2周是一个很好的开始。据报道,aav介导的基因表达相当稳定,在人类临床试验和狗身上持续了数年(Wonjo等人。,2013年)。

准备AAV时的注意事项:

在设计和成长之前 交付时及交付后
货物的能力 政府效价/卷
推广者(具体vs广泛) animal
血清型 - 组织/细胞抗性 感染的可视化
生产(DIY还是购买?) 感染后的时间

AAV是一种非常通用的病毒基因传递工具。您特定的研究应用程序的需求将决定合适的参数的AAV设计和交付。虽然您最终的血清型/效价/年龄的确定将在很大程度上依赖于试点实验,但您可以查看不断增长的文献,以获得适合许多不同生物系统的设计建议。在过去的20年里,有超过100个涉及AAV的临床试验开始了,看来在未来的几年里,这个工具将在治疗和基础研究领域保持流行。


非常感谢我们的客座博客Didem Goz Ayturk!

Didem沙丘状积砂AyturkDidem Goz Ayturk是康妮·佩佩科的博士后研究员,使用病毒工具调查视网膜的神经元电路。

参考文献

1.阿斯基森,罗伯特W.,Bruce C. Casto和William MCD Hammon。“腺病毒相关有缺陷的病毒颗粒。”科学149.3685(1965): 754 - 755。PubMed.PMID: 14325163

2.皮莱等。"腺相关病毒感染的必要受体"自然4:520(7588): 108 - 12所示(2016)。PubMed.PMID: 26814968

3.麦卡蒂,D. M.,保罗E.莫纳汉,理查德J.萨穆斯基。“自我互补重组腺相关病毒(caav)载体可促进有效的转导,而不依赖于DNA合成。”基因治疗8.16(2001)。PubMed.PMID:11509958

4.Vandenberghe, Luk H.等。在腺相关病毒制造过程中有效地将功能载体释放到培养基中,依赖于血清型。人类基因治疗21.10(2010): 1251 - 1257。PubMed.PMID: 20649475。pmed中央PMCID: PMC2957237

5.Veldwijk, Marlon R,等。“开发和优化一种基于实时定量pcr的测定AAV-2载体库存的方法。”分子治疗6.2(2002): 272。PubMed.PMID:12349826

6。熊文军,康斯坦斯·塞普科。在两个不同年龄的新生小鼠视网膜下注射的具有广泛活性启动子的AAV8载体的不同表达模式。视网膜退行性疾病。施普林格国际出版,2016。501 - 507。PubMed.PMID: 26427452

7.冈田克也、隆。高效的AAV载体生产系统:杜氏肌营养不良的基因治疗。开放存取出版社,2013。Intech网页

8. Wojno,Adam P.,Eric A. Pierce和Jean Bennett。“看到光明。”科学翻译医学5.175(2013):175FS8-175FS8。PubMed.PMID: 23467559

addgene博客上的资源伟德体育中心

在Addgene.org上的资源

话题:伟德BV下载AAV.

留下你的评论

分享科学变得更容易了……订阅我们的博客

订阅