切换到GECO?AAV编码钙传感器的概述

由Leila Haery

Leila Haery.

作为我们与之合作的一部分宾夕法尼亚州矢量核心,我们将扩大我们的钙感应工具的库存。在这篇文章中,我们将回顾我们将拥有的传感器的主要类别。

为什么监测钙?

监测大脑活动的一种方法是监测钙动态。在神经元中,动作电位时钙通道被激活,导致细胞质中钙水平短暂(约100毫秒)增加(称为钙瞬变)(Helmchen等人,1996;Koester和Sakmann,2000;赴,2001)。真核细胞胞浆中游离钙的浓度约为100 nM,在动作电位(Wadel等人,2007)。因此,钙水平是神经元激活的代理(Broussard等人,2017)。

使用钙作为神经元活动指示剂的主要局限性是其量也由其他生物处理调节,其速率可以根据细胞类型变化。因此,根据上下文,对来自钙水平的活动的推迟可以变得复杂(Badura等人。,2014年)。

下载病毒vectors 1伟德BV下载01电子书

单通道钙指示剂

钙传感器在钙结合时发出荧光单波长传感器基于单个伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光强度,响应钙结合而变化。当钙存在并与检测器结合时,在一个波长下测量这些传感器,通常转动“ON /荧光”,并且当钙不存在并且不绑定到传感器时,“关闭”(图1)。基本上,一旦引入大脑,您就可以看到这些传感器在活跃的神经元中点亮。当神经元变为无效时,钙水平恢复正常,传感器关闭。换句话说,这些传感器是可逆的,意味着钙可以离子离子,使传感器返回其关闭状态。

钙脱离传感器的速度如何尤为重要,对于测量不同类型的细胞信号传导。例如,对于钙具有更高亲和力的传感器需要更长的时间在钙水平恢复正常后关闭。这些传感器不擅长感测频繁事件,但足够敏感以检测从较少数量的动作电位产生的钙水平。

单波长传感器在总体亮度、开/关动力学和钙亲合力方面存在差异,基于这些特性,适合于各种应用。下面将描述这些变体。

在Addgene找到AAV钙生物传感器载体

jGCaMP6:

参考:Chen等人,2013

GCAMP指示器是一些最流行的钙传感器(并且已经通过各种迭代,直到当前的JGCAMP-X))。Gcamp指示剂基于改性的GFP,钙结合蛋白(钙调蛋白,凸轮)和M13肽。在结合钙后,CAM经历了改变GFP发色团的构象变化,导致GFP亮度增加。因此,可以使用沟槽指示器实时指示钙水平。Gcamp变体具有一定范围的开/关动力学,可用于测量不同类型的细胞活动。具体地,最快的变体(GCAMP6F)具有2.6倍的CA2 +亲和力(下kd)而不是慢变种(GCAMP6S)(表1)。结果,GCAMP6F具有比GCAMP6S更快的上升时间和衰减时间更快的4倍。更敏感,GCAMP6S能够检测小鼠中的99%的单一动作电位体内与GCaMP6f相比,GCaMP6f能够在84%的时间内检测单个动作电位。

表1。GCaMP6单动作电位动力学综述体内在鼠标v1中(改编自Chen等人,2013)

变体 荧光相对于静止状态的变化 衰减时间(1/2),女士 上升时间(顶峰),女士
GCaMP6s 23±3.2% 550±52 179±23
Gcamp6m. 13±0.9% 270±23. 80±7.
Gcamp6f. 19±2.8% 142±11 45±4.

jGCaMP7(即将到来的):

参考:Janelia研究所

最新版本的GCaMP传感器可以从道格拉斯金和Janelia研究所。这些GCAMP7传感器所有的信号幅度都比GCAMP6更大的信号幅度响应到单个动作电位刺激。各个传感器的优点如下(请参阅此处的数据):

  • jGCaMP7s- 是对动作电位的最敏感的响应者(对于单个动作电位,GCAMP7S相对于基线荧光,GCAMP7S大约是亮度的两倍,作为GCAMP7F变体,大约比GCAMP6亮大约5倍。)

  • JGCAMP7F -是最快的响应变体。

  • jGCaMP7b-显示出最亮的静息荧光,可用于成像小的神经元突起(树突和轴突)。

  • jGCaMP7c-表现出荧光峰值和静息荧光之间的高对比度(通过降低传感器静息荧光,同时保持高荧光峰值来实现),由于不活跃神经元的背景荧光减少,因此有助于成像大量密集标记神经元的信号活性。这种变体有大约12倍的亮度增加后~100动作电位。它的亮度是GCaMP7f和GCaMP7s的两倍。

虽然GCaMP蛋白质很有用,但它们的绿色性是有限的。它们的激发和发射光谱的波长被散射,并能损伤组织,限制成像深度体内。为了解决这些限制,基于类似架构的红色钙指示剂被开发出来(见jRCaMP1a, b和jRGECO1a)。

红色指标的一个优点是能够在GFP小鼠系中或在表达其他基于GFP的工具的小鼠中复用。在这种情况下,可以独立于其他基于gf的工具来测量红色指标。相对于绿光成像,红光成像通常也可以成像更深的组织,并且可以用更少的激发功率(Rose等人,2014)。这是因为光散射与波长成反比,其既适用于激发和发射灯。

jRCaMP1a, b:

参考:Dana等人,2016年

这些是基于MRUBY的红钙指标。JRCAMP1A和JRCAMP1B比JGCAMP6更敏感,但不显示光电开关在使用蓝光照明后(如jRGECO1所做的)。由于一些常见的光遗传学工具(例如,Channelrhodopsin, ChR2)是被蓝光照射的,因此jRCaMP1a, b对这种光的稳定性使它们适合于结合钙成像和光遗传学的实验。jRCaMP1a和jRCaMP1b也在稍长(更红色)的wav下运行与jRGECO1a相比,jRGECO1a能够提供更清晰的成像(参见上面关于散射的说明)。

jRGECO1a:

参考:Dana等人,2016年

这是一种基于mApple的红色钙指示剂,其灵敏度与jGCaMP6相当。基于枫树的GECIs,如R-GECO和R-CaMP2,在蓝光照射下表现出光开关,导致红色荧光瞬间增加,使其使用复杂化光遗传学工具(它们通常被蓝光激活)。

FRET-based钙指标

基于FRET的钙生物传感器与单波长传感器不同,烦恼基于钙传感器是基于两个荧光蛋白连接一个肽和钙结合域(如CaM或肌钙蛋白)。伟德2021足球欧洲杯买球平台钙结合使FPs更紧密,提高了两种蛋白质之间的FRET效率。这样,基于freet的钙传感器可以通过两个波长(供体发射波长和受体发射波长)进行量化。

Twitch-2B:

参考:Thestrup等人。,2014年

抽搐指示器包括通过接头和肌钙蛋白钙结合结构域连接的两个荧光蛋白伟德2021足球欧洲杯买球平台(FPS)(图2)。在没有钙的情况下,抽搐形成细长结构,其中两个FPS越远(〜5.2nm)。在钙的结合后,FPS更靠近(〜埃),增加供体和受体FP之间的效率。Twitch2b中的捐赠者和受体fps(mcorulean3和plvenusCD)的优点是供体发射光谱特别明亮。

FRET-based钙指标具有比静止时单波长传感器更亮的优点,可以更好地在细胞中显示(Thestrup等人。,2014年),并已被证明可以检测细胞内的钙(罗素2011)。然而,相对于基于FRET的指示器,GCAMP传感器具有更高的荧光变化的优点,响应CA2 +绑定(Russell, 2011)。例如,在钙结合时,Twitch-2B的受体FP荧光增加了约2倍(Thestrup等,2014),而jGCaMP6传感器的动态范围约为10倍(Chen等,2013)。

哎呀,我眨了眨眼 - 不可逆钙传感器的益处

当你实时观察大脑时,实时跟踪大脑活动的能力是非常棒的。但这些实时信号会关闭,只有当显微镜在它们被激活的时候聚焦在它们上才能被检测到(这基本上是受显微镜视野的限制)。从本质上说,实时传感器的优势在于能够长期检测大脑活动,但只是在小范围内。另一方面,使用不可逆的钙传感器,可以在不直接监测的情况下检测整个大脑的活动,但只持续几秒钟。

金巴利钙传感器金巴利:

参考:Fosque等人,2015

钙调制的可光激活比率积分器(Campari)与可逆钙传感器不同,因为它在用户定义的时间段内提供了钙活动的永久性记录。该集成商仅通过从绿色转换为红色,仅在高钙水平和用户提供的紫光的同时,只能在具有高钙水平和用户提供的紫光的存在下(图3)。这种永久性转化提供了在用户指定的时间段内将钙水平记录在大脑的宽区域上,红色荧光强度与钙浓度相关。Campari通过允许在大面积的细胞和组织中进行总钙活性测量来补充现有的钙指示剂。

底线

总的来说,现有的钙指标并不缺乏,但每种指标都有其优势和局限性。最佳指标将根据所测生物活性的类型而有所不同。


参考

1.关键词:快速钙离子传感器蛋白,神经活动监测,钙离子传感器Neurophotonics。2014年10月,1(2):025008。PubMedPMID: 25558464。公共医学中心PMCID: PMC4280659

2.用遗传编码指标监测神经回路的活动。2014;7: 97。PubMedPMID: 25538558。公共医学中心PMCID:PMC4256991.

3.陈涛、Wardill TJ、Sun Y、Pulver SR、Renninger SL、Baohan A、Schreiter ER、Kerr RA、Orger MB、Jayaraman V、Looger LL、Svoboda K、Kim DS。超灵敏荧光蛋白成像神经元活动。伟德2021足球欧洲杯买球平台《自然》,2013年7月18日;499(7458):295-300。PubMedPMID: 23868258。公共医学中心PMCID: PMC3777791

4Dana H、Mohar B、Sun Y、Narayan S、Gordus A、Hasseman JP、Tsegaye G、Holt GT、Hu A、Walpita D、Patel R、Macklin JJ、Bargmann CI、Ahrens MB、Schreiter ER、Jayaraman V、Looger LL、Svoboda K、Kim DS。敏感的红色蛋白钙指标用于成像神经活动。5.生活,2016年3月24日;pii: e12727。PubMedPMID:27011354。公共医学中心PMCID:PMC4846379.

5. FOSQUE BF,SUN Y,Dana H,Yang CT,Ohyama T,Tadross Mr,Patel R,Zlatic M,Kim DS,Ahrens MB,Jayaraman V,Looger LL,Schreier er。神经电路。设计钙集成商体内活动神经电路的标记。2015年2月13日; 347(6223):755-60。PubMedPMID: 25678659

6.Ca2+缓冲和动作电位诱发的Ca2+信号在锥体神经元树突中的作用。生物物理学J. 1996年2月;70(2): 1069 - 81。PubMedPMID: 8789126。PubMedPMCID: PMC1225009

7.赴b(2001)。离子通道的可激膜,第三Edn Sunderland, MA: Sinauer Associates Inc。

8.Koester HJ, Sakmann B.在幼龄大鼠新皮层2/3层锥体细胞的单个神经末梢的动作电位与钙动力学相关。J Physiol. 2000 12月15日;529 Pt 3(): 625 - 46。PubMedPMID:11118494。公共医学中心PMCID: PMC2270226

9.Rose T, Goltstein总理,Portugues R,和Griesbeck O.为GECIs画上句号。2014;7: 88。PubMedPMID: 25477779。公共医学中心PMCID: PMC4235368

10.拉塞尔,JT。体内成像钙信号:生理学和药理学的强大工具。BR J Pharmacol。2011年8月;163(8):1605-1625。PubMedPMID: 20718728。公共医学中心PMCID: PMC3166690

11.Thestrup T, Litzlbauer J, Bartholomaus我,μM, Russo L, Dana H, Kovalchuk Y, Y,梁Kalamakis G, Laukat Y,贝克尔年代,Witte G,盖革,艾伦T,罗马LC,陈TW, Kim DS Garaschuk O, Griesinger C, Griesbeck O .优化比率计钙传感器功能体内成像的神经元和T淋巴细胞。2014年2月,11(2):175-82。PubMedPMID:24390440

12.突触小泡和Ca2+通道之间的耦合决定了神经递质的快速释放。神经元。2007。53: 563 - 575页。PubMedPMID: 17296557

Addgene博客上的其他资源伟德体育中心

在Addgene.org上的资源

下载荧光蛋白101电子书伟德2021足球欧洲杯买球平台

主题:伟德BV下载,神经科学生物传感器,AAV,神经科学

留下你的评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅