AAV矢量质量控制:使用NGS的额外里程

由卡伦吉林

凯伦吉林

可重复的数据是科学的关键,因此科学家习惯于重复实验来证实他们的发现。但是没有科学家愿意因为试剂质量差而重复一个实验。为了确保我们的AAV载体是最高质量的,我们承担了一个严格的质量控制过程-阅读了解更多!

去年,我们推出了病毒服务继续我们加快科学研究的使命。目的:确定Addgene上可用的腺相关病毒(AAV)载体是适合的在活的有机体内研究,我们的科学家执行所有标准质量控制检测装甲防护。这些步骤包括测量病毒滴度和评估纯度。但Addgene也在进行更严格的质量控制,包括识别PCR和下一代测序(NGS)病毒基因组。此外,我们尽可能检查转导细胞中的病毒转基因表达。这篇文章将描述我们的病毒基因组测序(VGS)工作流程。

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为什么要关心病毒质量控制?

AAV载体是由科学家制造的,而不是机器人。不幸的是,人类也会犯错。如果一个试管贴错了标签或者有人拿错了质粒怎么办?如果细菌在生产过程中潜入了准备阶段怎么办?这些问题在并行产生多个向量时特别重要,因为意外错误的风险增加了。

除了人为错误,辅助质粒或细胞基因组的DNA片段可以在生产过程中被包装在载体内。这些杂质不能在净化步骤中去除,因为它们是内部病毒本身。虽然这些杂质通常被认为对研究级载体无害,但我们希望确保它们以非常低的浓度存在。那么我们如何确保在分配矢量之前捕捉到所有这些潜在的事故呢?

病毒基因组测序

感谢我们的与seqWell合作,我们现在可以使用NGS对病毒颗粒内包装的所有DNA进行测序(图1)。简单地说,包装的DNA是从纯化的、经过DNA酶处理的AAV中提取出来,然后提交给NGS。对原始测序数据进行分析,以确定包装DNA的身份,并寻找潜在的污染物。

病毒基因组测序工作流程

分析是一个2步的过程使用Geneious软件:

首先,单个测序reads(每个约150 bp)与用于制造病毒准备的质粒的参考序列对齐aav - 44362如下所示,超过90%的读取应该与这个参考序列一致。其次,我们对所有没有映射到引用序列的读取执行megaBLAST搜索。然后仔细审查结果列表。如前所述,通常可以从包装细胞基因组、细菌基因组、克隆载体和辅助质粒中找到DNA(1,2)。事实上,大多数撞击来自这些已知的杂质,就像洁净样品AAV-44362的情况一样。除了这些预期的撞击,我们总是会受到“随机”基因的撞击。这些撞击都意味着样本被污染了吗?不,真正重要的是同一序列(基因)的命中次数。在一个干净的样本中,对一个给定序列的点击通常少于10次,我们相信这不是值得关注的原因。然而,对一个序列/基因的大量点击——我们将阈值设为> 100次——马上就会发出危险信号。例如,AAV-68544含有220个CHRM4基因。

病毒基因组测序分析

如果怀疑有污染,我们继续新创组装利用我们的生物信息学软件,在不使用参考序列的情况下,将这些reads组装成更长的DNA序列。读取总数最多的5个contigs最有可能对应于污染物。然后是每个contig抨击与NCBI核苷酸收集数据库进行比对,它也可能与我们库存中含有疑似污染序列的质粒进行比对。在大多数情况下,污染源是可以识别的我们会丢弃任何可能被污染的AAV制剂。对于AAV-68544,最优匹配为Addgene质粒#44362。

方法验证、限制和未来计划

AAV-68544是如何被污染的?我们故意将另一种AAV载体与AAV-68544 t混合验证我们的方法。然后,我们提取DNA,将混合样品在我们的管道中进行处理(见图2,样品2)。当我们盲目分析AAV-68544时,我们很容易识别出我们以5%的浓度混入原始AAV样品中的污染物AAV-44632。检测出5%的污染是一个好的开始,但我们也在努力提高我们的检测限度。我们目前正在测试只有0.1%污染的混合样品O测定我们方法的灵敏度

我们目前正在努力使我们的VGS方法适用于含质粒液态氧序列Cre-mediated重组。这些序列可能在细菌质粒生长过程中受Cre独立的重组作用,重组产生的预重组质粒群体不需要Cre进行转基因表达。一旦被包装在AAV中,这种预重组DNA可能导致转基因表达在cre阴性的动物中,产生误导性的结果。我们希望能够在不久的将来用VGS探测到这些事件。目前,我们正在对我们所有的aav进行鉴定PCR (ID-PCR),用设计的引物对检测重组事件。

下一代测序(NGS)是一种强大的工具,可用于识别AAV制剂中的DNA污染物,并提供有关这些DNA物种的详细信息(3.)。这种更高水平的质量控制是推荐的,但对于临床级材料还不需要,对于研究级材料通常也不需要。Addgene将会更进一步,开创这种新的QC检测系统的使用,以确保您获得最佳的AAV载体用于您的研究。

如果你有任何关于病毒DNA NGS的具体问题想让我们讨论,请在下面的评论区告诉我们。我们也可以通过电话或help@addgene.org回答您关于我们质量控制过程的问题!


这篇博文中的图片是用Snapgene和genious软件制作的。

参考文献

1.Chadeuf, Gilliane等。重组腺相关病毒生产过程中原核生物序列的包封证据在活的有机体内矢量交付后的坚持。”摩尔。12(4)(2005): 744 - 53。PubMedPMID: 16023415

2.赖特,j·弗雷泽和奥尔加·泽莱纳亚。重组腺相关病毒质量控制检测的载体鉴定方法杂志的方法。737(2011): 247 - 78。PubMedPMID: 21590401

3.Lecomte, Emilie等。单链病毒下一代测序制备rAAV载体中DNA分子的高级表征分子Ther核酸。4 (2015): e260。PubMedPMID: 26506038。公共医学中心PMCID: PMC4881760

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