新一代腺嘌呤基础编辑器改善了初级人体细胞中的编辑

由Susanna Bachle.

腺嘌呤基础编辑器(ABE)调解A•T-to-G•C基础变化(图1),但是使这些基础变化可能具有挑战性,特别是在原发性人体细胞中。现在,科学家们梁治疗剂已经找到了改善初级人体细胞(Gaudelli等,2020)中编辑的方法。

其中一个广泛使用基础编辑系统,ABE7.10(以及新一代ABES的起点),包括3个组件:

  • 一个脱氨酶(Tada,最初来自E.coli,名为TADA7.10在ABE7.10)
  • 催化受损的CA蛋白(DCA或CAS酸酐)
  • 将TADA和DCA的复合物定位为感兴趣的基因组DNA的指导RNA
图Abe8梁博客帖子
图1.当ABES发生时,它们结合DNA,使TADA结构域可以编辑可接近的短单链DNA舒展。图片来自Gaudelli等人。,2020年

定向演进识别adenine基础编辑器,并在细胞系中改进了编辑

妮可Gaudelli.他是Beam Therapeutics的副主任兼基因编辑技术负责人以前开发的细菌选择策略(Gaudelli等,2017)与TADA序列的合成文库相结合,以创造第八代腺嘌呤基础编辑,称为ABE8(Gaudelli等,2020)。生成的abe8s需要产生3个并发基础编辑以承受抗生素选择。因此,塔达的8个突变可以创造所有三种编辑,因此更有效。通过这些突变和先前描述的TADA突变(Gaudelli等,2017),它们被修改为ABE7.10,导致了名为“ABE8.x”的变体:“8”代表第八轮的ABE演变和“X“是占号的占位符,用于识别进化的TADA域中的突变。

因为ABE7.10包含野生型TadA和TadA7.10的异二聚体融合,他们设计了一套类似的ABE8的(ABE8.x-d)。为了评估从复合物中去除野生型TadA的效果,研究人员开发了第二组:

  • ABE8.X-D版本融合了野生型TADA和演进的TADA地区。
  • ABE8.X-M版仅包含演进的TADA,比abe8.x-d小〜500键对。

这完全在40个新的Abe8变体中得到了。当对这些版本的人体细胞系比较目标DNA编辑效率时,他们发现较小的版本ABE8.X-M显示了对ABE8.X-D的相当的编辑行为。总体而言,与ABE7.10相比,ABE8显示了124倍编辑活动的中位数增加。根据原创器中的位置,ABE8S的编辑容量范围为1.5倍,对于位置A3-A4和A8-A10的位置较高的位置A5-A7至3.2x。

研究人员选择了8个测试的ABE8构建体(ABE8.8-M / D,ABE8.13-M / D,ABE8.17-M / D,ABE8.20-M / D)进一步评估。

由ABE7.10的催化受损的D10a酸酐酶意外插入和缺失(Indel)的产生可能是一个问题。因此,作者使用催化“死”创建了ABE8构建体链球菌CAS9(DC9-ABE8.X-M / D)。DC9-ABE8.X-M / D构建体在人体细胞系中展示了2.1倍的目标DNA编辑效率,同时与ABE7.10相比减少了90%以上的诱导频率。

选择Cas9蛋白质以增加腺嘌呤基础编辑器的靶向范围

最常用的链球菌Cas9要求基因组DNA中的靶位点含有由5'-ngg-3'(“n”组成的相邻的基序(PAM)的特定原始基序(PAM)可以是任何核苷酸碱,然后是2个鸟嘌呤)。这限制了APES作为不含合适PAM的DNA位点的使用不能有效地编辑。为了扩展ABE8的目标范围,团队更换了链球菌Cas9在Abe复合体与Pam-Variant Cas9蛋白质:该S.pyogenes.ng-cas9(pam:ng)创建ng-abe8.xm / d和S.金黄色葡萄球菌CAS9(PAM:NNGRRT)以创建SA-ABE8.X-M / D.通过这些变体,ABE8可以针对基因组中的许多额外位置。与ABE7.10相比,NG-ABE8.XM / D显示1.6倍增加增加,SA-ABE8.X-M / D在ABE7.10上编辑频率的2x中位数增加。在ABE8复合体中使用非标准CAS9的能力使得基本编辑的更广泛的定位范围。

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基础人体细胞中的基础编辑

细胞疗法方法可以使用基础编辑器来纠正干细胞中的突变,并将校正的细胞返回给患者。例如,可以随着胎儿血红蛋白的表达而减轻血红蛋白(葡萄球菌)中的缺陷,其导致镰状细胞疾病和-ThalAssemia。以前的研究表明,即使在成年患者中,γ血红蛋白的启动子区域(HGB1 / 2)的启动子区域的一个基础变化导致胎儿血红蛋白的连续表达。为了分析ABE8对原发性人体细胞编辑的临床应用,研究人员在CD34 +造血干细胞中测试了ABE8。ABE8有效地编辑了胎儿血红蛋白启动子,并导致胎儿血红蛋白的持续表达到比ABE7.10更大水平。

除了干细胞外,作者除了选定的ABE8和ABE7.10中,作者在原代人T细胞中靶向6个基因。它们通过测量这六个基因的蛋白质表达的还原来定量基因组编辑。所有ABE8S都比ABE7.10更有效地编辑了ABE8.20-M的蛋白质表达最多的原代人T细胞。

在编辑单一基因非常有用时,有时,您需要修饰多种基因以产生细胞表型。再次abe8.20-m是赢家。它可以同时编辑3个基因(98.1%,98.3%,或98.6%的效率),并且优于ABE7.10至少1.4倍。ABE8.20-M进行编辑初级人T细胞的能力有效地使其成为T细胞疗法发展的有希望的工具。

减少ABE8S中的离心编辑

虽然基础编辑器是精确的分子工具,但它们确实具有不希望的脱靶编辑效果。已经描述了eBES引入脑育DNA和RNA依赖性的基础变化或独立于所用的GRNA(Gaudelli等,2017)。作者测试了ABE8.17-M,发现一个基础变化突变(ABE8.17-M + V106W)(Gaudelli等,2020)能够减少离药RNA和GRNA依赖性DNA编辑,同时保持 -目标基本编辑功能。

基础编辑器的传递方法扮演了非目标编辑效果的作用。可以将蛇形作为质粒或mRNA构建体引入细胞中。在初级人体细胞中,ABE的mRNA递送导致更有效的目标编辑和降低的离心编辑频率。对于需要高DNA编辑特异性的应用,例如用于潜在的治疗方法,作者推荐MRNA交付,ABE8的v106W版本,以及思想选择GREENAS。特别是特别说明,在这项工作中报告的ABE8S没有导致基因组,导向无关的脱靶脱胺,这是治疗应用的重要属性。

ABE8S展示了整体改进的基本编辑能力,即使在难以瞄准的网站上也是如此。特别是,它们在人体细胞系和主电池中更强大地编辑的能力使它们成为基础编辑工具箱的一个很好的补充。

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参考文献

Gaudelli NM,Komor Ac,Rees Ha,Packer Ms,Badran Ah,Bryson di,Liu Dri(2017)在没有DNA裂解的基因组DNA中的A•T至G•C的可编程基础编辑。自然551:464-471。https://doi.org/10.1038/nature24644

Gaudelli NM, Lam DK, Rees HA, Solá-Esteves NM, Barrera LA, Born DA, Edwards A, Gehrke JM, Lee S-J, Liquori AJ, Murray R, Packer MS, Rinaldi C, Slaymaker IM, Yen J, Young LE, Ciaramella G (2020) Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology.https://doi.org/10.1038/s41587-020-0491-6

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