CRE-LOX和FLP-FRT的高级用途 - 神经科学家的观点

由Guest Blogger.

这篇文章由Guest Blogger Katrin Michel贡献。

CRE-LOX.是一个令人难以置信的流行和强大的站点特定的重组酶(SSR)系统,但它只为您提供单一的控制级别而无需修改 - 无论是在那里都没有。Cre-Mediated用于DNA重组和基因表达的特异性特异性(和通常特异性特异性)控制的可能性可以通过SSR系统FLP-FRT的协调使用来推进。此外,已经开发出各种对伐木语造型的FLP和CRE表达的方法。阅读了解有关FLP-FRT,CRE-LOX的更多信息,以及FLP和CRE的组合如何实现额外的遗传控制。

什么是FLP FRT,它如何运作?

FLP重组酶以其反转或“翻转DNA”的能力命名,衍生自酵母S. Cerevisiae.Gronostajski和Sadowski 1985年)。FLP系统以类似的方式工作到CRE系统。FLP重组酶识别FRT位点,并启动这些位点之间的网站定向基因重组。FRT网站和LOXP位点在核苷酸水平下不同,但共享由8bp不对称芯分开的13个碱基对戊重复的整体结构。这些位点之间的重组可以以类似的方式导致DNA的切除,反演和易位,如LOXP网站(详见)CRE-LOX博客帖子)。

通过智能工程优化FLP FRT

不同的FLP版本 - 使FLP高效

FLP发现的第一个版本的温度最佳为30°C,因此哺乳动物细胞中效率低下(通常在37℃下生长)。智能分子演变导致识别具有37°C的温度最佳的FLPE(Buchholz,Angrand和Stewart 1998)。通过添加核定位序列(SV40大T核定位序列)并从CAGGS启动子表达它,进一步改善了FLPE的性能。然而,FLPE仍然比CRE重组酶更低。FLPE密码子优化导致FLPO,其显示对CRE的效率相似(Kranz等人。2010年)。

在决定是否在实验中使用CRE-LOX或FLP-FRT系统之一时,重组酶效率的这些差异非常重要。

Flex Vectors中的变异FRT和LOXP站点 - 仅一次

FLP或Cre介导的所有重组事件都是可逆的。而loxP/FRT位点两侧的DNA片段的切除比其再引入更有利,倒置和再倒置发生的概率相同。所关注的DNA序列的持续倒置可能导致该序列内基因的表达不良,因此应加以防止。

已经设计了LOXP和FRT目标网站以避免此重新反演问题。它变得可以设计Flex矢量图(翻转viecision vectors)仅允许一个反转事件发现它不是非对称目标站点核心的确切顺序,而是其8bp长度对于CRE和FLP功能至关重要。因为重组只能在弯曲载体中的相同序列的靶位点之间发生,所以应该反转的DNA序列侧翼在其序列中不同的两对靶位点。具有相同序列的两个靶位位点之间的重组导致侧翼DNA序列和内部靶位点的反转。在第二步中,两个相容的靶位点被切割出来,留下载体,其中倒置的DNA侧翼被不相容的靶位点(Schnütgen等人。2003年)。

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Flex矢量彻底改变神经科学

神经网络中特定细胞类型的操纵

表达光诱导离子通道的双倒矢量(质粒#20298例如)彻底改变了神经科学。它们是目标和操纵特定细胞类型的唯一意义(种群)在生物动物中的神经元网络中。完成这种细胞特定的操纵体内,在CRE重组酶控制下表达光可活性离子通道的柔性载体与仅在细胞类型的兴趣中表达CRE的小鼠线(atasoy等人。2008;Cardin等人。2009年)。

配体调节重组酶 - 保持克雷直到所需

但是,只有在特定时间点发生重组时可以做些什么?为了允许时间对照,已经开发了配体调节CRE和FLPE重组酶。实现配体控制的常见方法是将突变雌激素受体(ER)配体结合结构域(LDB)熔化为FLP或CRE的C-末端(pCAG-CreERT2 # 14797)。这些Cre/ FLP版本保留在细胞质中,直到添加雌激素受体配体他莫昔芬。然后它莫西芬与融合的ER-LDB结构域结合,允许Cre/FLP易位到细胞核,在那里它们发挥重组酶活性(Logie和Stewart 1995;Metzger等。1995年)。

在生活大脑中可视化单个神经元

Cre条件鼠标

如何在生活大脑中标记单个神经元及其突触?可以通过分发特定脑区域的细胞在子宫内电穿孔。为了实现单个神经元的稀疏标记,可以减少质粒数量以降低转染效率。然而,如果一个神经元和它的突触的细胞结构同时从两个不同的质粒中可见,这种方法就会产生问题,因为它降低了神经元被两个载体转染的概率。弯曲向量就是解。

表达荧光细胞质标记物(例如EYFP)和突触蛋白(例如后腹膜PSD95-MCHERRY)的柔性载体以高浓度与表达所需重组酶的低浓度的载体组合使用。高浓度的弯曲载体保证大多数细胞用所有标记质粒转染,并且低浓度的重组酶限制它们对单个细胞的表达。利用这种技术,神经科学家可以看到单个细胞的完整树突结构,其所有突触以及它如何随着时间的推移重新排列这些突触(Villa等。2016年)。

梳理FLP和CRE进行额外的控制

CRE翻转鼠标

科学家总是追求更多。为了分析单个蛋白在神经元回路或突触重构中的功能,研究人员结合了Cre和FLP重组酶来控制一个靶基因的敲除和一个单独的基因的表达。在这些小鼠系中,Cre重组酶的表达可以诱导基因敲除,而后续实验所需的蛋白质(如细胞跟踪)可以用FLP-FRT控制。为了进一步的时间控制,他莫昔芬诱导的Cre版本可用于这些实验。这种Cre、FLP和诱导系统的完美结合,使研究人员能够在特定的时间内精确地控制特定细胞中多个基因的表达。


非常感谢我们的嘉宾博主,Katrin Michel!

卡特琳米歇尔Katrin Michel是一名博士后研究员,由基因和蛋白质如何坐标数十亿神经元来形成人脑的功能网络。

确认:
通过与基类型的合作,我们能够分配包含Flex技术的材料。阅读基因送释放想要查询更多的信息。

参考文献

1. atasoy,d。,y.pante,h. h. su和s. m. sternson。“Flex Switch将ChannelRhodopsin-2定位到多个单元格类型进行成像和远程电路映射。”神经科学杂志28(28):7025-30。PubMed.PMID:18614669.。pmed中央PMCID:PMC2593125

2. Buchholz,F,P O Angrand和A. Francis Stewart。1998年。“通过循环诱变改善了FLP重组酶的性质。”自然生物技术16(7):657-62。PubMed.PMID:9661200

3. Cardin,Jessica A.等。“驾驶快速尖峰细胞诱导γ节奏并控制感官响应。”自然459(7247): 663 - 67。PubMed.PMID:19396156.。pmed中央PMCID:PMC3655711.

4.Gronostajski, R M,和P D Sadowski, 1985。酿酒酵母2微米质粒的FLP重组酶通过磷酸酪氨酸链共价连接到DNA。分子和细胞生物学5(11):3274-79。PubMed.PMID:2427927。pmed中央PMCID:PMC369144

5. Kranz,Andrea等。2010.“基于FLPO重组酶的C57BL / 6中改进的FLP DELETER鼠标。”《创世纪》48(8):512-20。PubMed.PMID:20506501.

6. Logie,Colin和弗朗西斯斯图尔特。1995年。“配体调节的场地特异性重组”。Proc。Natl。阿卡。SCI。美国92(6月):5940-44。PubMed.PMID:7597057。pmed中央PMCID: PMC41617

7. Metzger,D,J Clifford,H Chiba和P Chambon。1995.使用配体依赖性嵌合CRE重组酶“哺乳动物细胞中有条件的位点特异性重组。”Proc Natl Acad Sci U S a92(15):6991-95。PubMed.PMID:7624356.。pmed中央PMCID:PMC41457

8.Schnütgen,弗兰克等“2003年。”在小鼠细胞水平下监测CRE介导的重组的定向策略。“自然生物技术21(5):562-65。PubMed.PMID:12665802

9.Villa, Katherine L.等人,2016。抑制性突触在体内的持久性位点反复组装和移除。神经元89(4):756-69。PubMed.PMID:26853302。pmed中央PMCID: PMC4760889

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