一个“秀丽隐体”方法,以更好的CRISPR / CAS9编辑效率

由Guest Blogger.

最初发布2015年1月27日,最后更新了12月17日,2020年。

这篇文章是由Jordan Ward是加州大学圣克鲁兹分校的助理教授。

使用C.杆状杆的CRISPR来插入选择性标记。新兴CRISPR / Cas9编辑技术在各种生物和细胞系中改变了实验的调色板。在秀丽隐杆线虫,我用来在发育过程中研究基因调节的模型生物之一,CRISPR / CAS9允许我们删除序列并引入突变和表位,以前所未有的便利。这些新的秀丽隐杆线虫方法快速丰富编辑事件,而不需要任何选择性标记保留在编辑动物。

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开发CRISPR / CAS9编辑策略秀丽隐杆线虫

在寓言中表现出色和不可思议遗传学家与生物化学师在美国,我们遗传学家是一群懒惰的人,他们喜欢依赖于基因选择的可怕力量。敲入事件往往很少,任何实验的挑战都是如何有效地恢复这些编辑。最初的工作秀丽隐杆线虫依赖于耐药性的选择性标记(等等。,2013年),荧光(GFP;Tzur等等。,2013),或拯救突变表型(UNC-119.)(狄金森等等。,2013年)。这些方法允许有效地恢复敲扣,但确实导致介绍1-2千千千碱类的额外序列。CRE介导的切除选择性盒子中最小化添加的序列,留下34bp“疤痕”,但目前需要额外的实验操作。在某些情况下,需要注射CRE,然而自我切除盒的发展(Dickinson等等。,2015年)使这一步像热休克一样简单,以诱导基因敲入中包含的Cre重组酶的表达。包括cre介导的标记的切除,大约需要3-4周的时间来获得一个纯合子,异交敲入准备用于实验。

2014年,几篇手稿出版于遗传学对产生可见表型的编辑事件的选择丰富了其他基因组位点上的敲除和敲入的详细方法。第一种方法,共同crispr来自Craig Mello的实验室-使用灭活的unc-22基因作为选择标记(等等。,2014年)。同时安迪火的实验室用于显性突变的低聚介导敲入,称为共转化(arribere., 2014)。在这两种情况下,必须去除所选择的突变,这可以通过将动物分离具有特定的可见表型来完成。在报告之后,这些方法可能会更加强大,其中一个人可以使用线性修复模板(即PCR衍生的DSDNA),其中包含30-60个基座同源臂敲入大型表位(如GFP)(Paix.等等。,2014年)。2017年报告了这种方法的进一步发展,使用直接注射CRISPR / CAS9核糖核蛋白复合物与线性DNA作为修复模板减少生成编辑只有四天的时间(Paix等,2017)。共克切和共同转换方法具有在任何遗传背景中使用的优势,但需要可变的实验性操纵和筛选。

C. elegans中的Crispr编辑的共同选择策略提高了效率

我很幸运 - 或者不幸的是,根据视角 - 在我的初步直接筛选工作中使用效率低下的SGRNA,这与Paix详细的方法类似等等。尽管我能够在我感兴趣的基因中敲入一个2xFLAG表位,但我遇到了低效率(0.13%)和费力的处理(筛选768只F1动物)。在一大堆未经编辑的动物中恢复罕见的编辑事件,对我来说就像“大海捞针”,这促使我探索其他方法。作为一名“懒惰”的遗传学家,我开发了一种共同选择方法,依靠修复条件致死性突变,以最小的筛选努力来识别编辑。选择对致命突变进行修复应去除大量未编辑的“干草堆”,促进编辑动物的恢复。

使用C.杆状杆子的CRISPR敲击标志标签。

2015年(病房里,2015),我证明了修复温度敏感的选择PHA-1突变显着富集2x和3xFlag表位进入其他非连接的基因座;PHA-1(E2123)突变的蠕虫在15ºC下完全存活,但在25ºC下表现出完全的胚胎致死率。该方法的效率为11-100%,可以在8天内获得纯合子的基因敲入动物。除了亲代动物,盘子上唯一的动物都是获救的后代,这使得筛选极其迅速。这种严格的选择使我能够优化一系列的编辑参数:同源臂为35- 80bp的寡核苷酸修复模板,从期望的插入位点到DNA双链断裂54 bp,从而实现高效的编辑。修复寡核苷酸不需要PAGE纯化,尽管这样做会增加敲入效率。最后,如图所示果蝇S2细胞(Böttcher.等等。,2014年),非同源终连接的失活导致敲击效率的进一步增加,推测通过将DNA突破到同源重组修复途径中。需要执行的试剂PHA-1通过协调转换Addgene。2019年,Farboud等等。描述了另一个类似的同类共转换标记(修复A.ZEN-4(CLE10TS)等位基因),增加实验选择。

扩展和改进CRISPR/Cas编辑工具箱Celegans.

最近的工作进一步提高了CRISPR的基因组编辑的效率,无论是改进的GRNA还是修复模板设计,交付,筛选等。以下是过去几年的一些亮点:

修复模板设计

Meyer Lab精心特征在于编辑的几个方面。首先,他们设计了设计单股修复模板的指南(Farboud等,2019)。

Mello实验室也报道了通过PCR修改用于产生线性dsDNA修复模板的oligos的5 '修饰提升效率(Ghanta等。,2018)。他们进一步建立了这项工作,发现了这一点熔化和快速冷却DSDNA修复模板大大提高了编辑效率(Ghanta等人,2020年)。他们还发现大多数的基因敲入发生在注射后的24小时内,这使得筛选基因敲入更加有效。纯PCR修复模板对于有效的基因敲入至关重要(Ghanta et al., 2020)。总的来说,这些来自Mello实验室的改进带来了惊人的高编辑效率,从一个注射动物中获得了多达100个独立的GFP基因。

PAM序列的考虑

对于PAM的变化5',与PAM产生相同的股线的序列产生较高的编辑效率,而对于对应于相反股线的PAM序列的编辑3'较好(Farboud等,2019)。

Meyer实验室还确定了使用两个Cas9靶标编辑PAM的最佳取向。PAMs的5 '端向外的方向,确保在DSB形成后PAMs仍在染色体上,是最有效的(Farboud et al., 2019)。利用这种方法,他们能够在1.5 kb的通道中插入10kb的非同源序列或一系列单核苷酸替换,所有这些都没有可选择的标记。

CRISPR在Celegans.

Meyer和Mello Labs还确定了几种实验组,可以提高CRISPR效率Celegans.Meyer Lab还发现交配改进的编辑效率,表明精子对Cas9编辑更加宽容(Farboud等,2019)。Mello Lab的工作大大改进了使用线性修复模板的RNP编辑。他们发现Cas9 RNPS可以在高浓度下有毒,并通过使用更稀释的混合物来改善效率(Doksin等,2018)。MELLO实验室还报告了使用主要丢失在F2动物中的共注注记器的高效编辑,除去了远离共转化标记的需要。

海外扩张Cas9

自CRISPR / CAS9编辑方法的发展以来,其他CAS蛋白已适用于Celegans.。2017年,Korswagen Lab开发CAS12A(CPF1)进行编辑Celegans.(Ebbing等,2017)。因为秀丽隐杆线虫如果具有富含at的基因组,则很难找到合适的NGG PAM位点作为靶标。(T)TTN PAM motif需要acidaminococcus sp.。BV3L6 Cas12a (AsCpf1)缓解了这个限制,允许从更多的站点编辑Celegans.基因组。

用于编辑的工具包Celegans.

开发工具包等saptrap crispr / cas toolkitsaptrap-sec套件Celegans.基因组工程还促进了Crispr编辑Celegans.。这些模块化工具包构建了编码GRNA转录物的单个质粒靶向载体和您选择的修复模板。Saptrap Builder等工具大大简化了这些构造的设计,允许新手研究人员快速轻松地开始基因组编辑(Schwartz等,2018)。

要查看更多CRISPR工具Celegans.,请访问Addgene的秀丽隐杆线虫CRISPR质粒页面。

未来的视角

有趣的是要注意的收件人2015年突破奖包括Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier,因为他们开创性的CRISPR/Cas9工作(现在被2020年诺贝尔化学奖认可),以及Victor Ambros和Gary Ruvkun,因为他们在微rna方面的开创性工作秀丽隐杆线虫。的秀丽隐杆线虫在无数其他系统上通知小RNA的工作,而且将CRISPR技术导入秀丽隐杆线虫一直是我们社区的变革创新。使用改性CAS9蛋白的哺乳动物和酵母细胞的发展来调节基因表达(克里普利/Crispra.),可视化特定基因组基因座(CRISPR-成像),或寻找与给定基因组位点相关的蛋白质(CRISPR-ChAP-MS)可以进一步改变想象力的实验范围秀丽隐杆线虫。同样,本文中概述的一些“elegans”方法——特别是共选择方法的使用——可以极大地简化其他生物体和系统的编辑,从而在更广泛的领域中取得快速进展。


谢谢我们的博客!

乔丹瓦尔 - 分钟Jordan Ward是加州大学圣克鲁兹分校的助理教授,他的研究小组专注于线虫蜕衣和精子发生的基因调控。他的团队还开发工具来改进基因组编辑和有条件地操纵蛋白质。在他的网站上了解更多网页或者跟着他推特

参考文献

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