CRISPR 101:防克隆蛋白切断CRISPR-CAS系统

由Beth Kenkel.

最初发布于2017年5月23日,最后更新了Jennifer Tsang的最新7月23日,2020年7月23日。云顶娱乐 韦德国际

抗寒可靠的交换机CRISPR-CAS技术不断发展。CAS蛋白的变体可用于基因组编辑激活基因表达压制基因表达, 和多得多。但是还缺少一件事:一种关闭Cas活动的方法。值得关注的是Cas在细胞中保持活跃的时间越长,发生脱靶编辑的机会就越大。尽管方法来打开Cas活动使用或者毒品已经开发出来,该领域缺乏CAS蛋白的“脱机”。

发现防克隆蛋白质

那是,直到发现防克隆蛋白质2012年(Bondy-Denomy等,2012年)。抗CRISPR(ACR)蛋白是噬菌体衍生的小蛋白质抑制剂的CRISPR-CAS系统,其有助于噬菌体逃避细菌的CRISPR-CAS免疫系统。这些ACR蛋白最初被发现I型CRISPR-CAS系统

四年后,Sontheimer.和Davidson Labs发现II型系统的三种防克隆Neisseria Meningitidis.(NME)(Pawluk等,2016)。虽然链球菌Pyogeneses Cas9(SPYCAS9)是最常用的,并且学习良好的CRISPR系统,N. Meningitidis.也可用于基因组编辑。在这项研究中,实验室发现了这一点防克隆防止Cas9活动在HEK293中通过将〜30%的对照样品中的〜30%的编辑减少到ACR样品中的0-10%。ACR蛋白也可用于预防DCAS9至DNA。

自这些早期的防克里普尔研究,科学家有发现了超过50个抗克隆蛋白与CRISPR-CAS系统相互作用,例如Cascade-Cas3,Cas9,Cas12和Cas13(Marino等,2020)。一些ACR蛋白特异于特定的CA蛋白,而其他ACR蛋白质可以抑制来自多种细菌的CRISPR酶。

关于防克里克尔命名的一项说明

ACR系列蛋白质被命名为它们阻止的CRISPR-CAS系统类型,并按发现顺序编号(Bondy-Denomy等,2018)。例如,上述acria4表明它是第四型ACR蛋白发现,块II-A CRISPR-CAS系统。通过它们阻塞的CRISPR-CAS系统的类型组织的全部ACR蛋白清单可以在这里找到

下载addgene的crisprup 101电子书!

抗克里克人蛋白如何工作?

抗CRISPRS蛋白质是高度多样化的,但大多数块CRISPR活动三种方式中的一种:

  1. 抑制DNA结合
    1. 示例:Acria4.阻止Cas9与PAM网站的互动(Dong等,2017),Acriic3导致CAS蛋白Diferize阻止PAM识别站点(Harrington等,2017)。
  2. 抑制CRRNA装载
    1. 示例:Acriic2与Cas9的交互干扰和防止CRRNA-CAS复合物的正确组装(Zhu等,2019)。
  3. 抑制DNA裂解
    1. 举例:Acriic1与Cas9的HNH内切核酸酶染色并防止靶DNA裂解(Harrington等,2017)。
显示CAS蛋白和GRNA形成复合物,结合DNA和切割DNA的示意图。在每个步骤中是抗克切者蛋白的例子,可以抑制每个步骤
图1:防克隆蛋白(ACR)可以通过许多方式阻断CRISPR活性,例如抑制CRRNA装载,抑制DNA结合或抑制DNA裂解。

在您的实验中使用抗CRISPR蛋白

减少偏离目标效果

延长的CAS活动可以增加偏离目标编辑的机会,特别是在大部分目标编辑后发生了偏离目标编辑。防克隆蛋白可用于限制这种非目标编辑,但何时是关闭CAS活动的最佳时间?使用抑制剂时序实验Doudna Lab.发现,至少50%的目标CAS9编辑在前六个小时内发生。在引入Cas9 RNPS后六小时添加到人体细胞时,Acria4减少了脱离目标编辑,同时仍然允许目标编辑(Shin等,2017)。

ACRS也可用于减少离目标编辑基础编辑器,将核苷酸碱基对转化为特定位点的另一个碱基对。

CRISPR活动的时间,空间或有条件控制

通过诱导启动子、光或小分子调控Acr蛋白可以实现对CRISPR-Cas活性的快速、动态和空间控制。例如,融合ACRA4II到光敏LOV2域允许防克劳普的活动成为由蓝光控制(Bubeck等,2018)。

减少组织中CRISPR-CAS编辑的细胞毒性

ACR蛋白的小尺寸(〜50-200氨基酸)意味着它们可以递送体内使用AAV载体。有一种关闭CRISPR-CAS系统的方法防止偏移效应和细胞毒性由组织中过量的核酸酶活性导致(Li等人,2018)。

在工程病毒时选择标记

ACR基因可作为工程病毒中的阳性选择标记用作阳性选择标记。例如,使用ACR基因在难以为工程师Sulfolobus岛状杆状病毒2中替换基因(Mayo-muñoz等,2018年)。只有基因缺失的病毒颗粒可以在攻击时恢复S. islandicus.CRISPR-CAS系统。

噬菌体疗法

噬菌体疗法使用噬菌体治疗细菌感染作为抗生素的替代品。但由于许多细菌病原体具有CRISPR-CAS系统,因此噬菌体疗法可能不如效果。这是ACR蛋白进入的地方。ACR蛋白足够小,以至于它们可以设计成“装甲”治疗噬菌体,以保护它们免受致病细菌的CRASPR-CAS系统。

结论

Crispr是制作那些基因组编辑的好方法。但是,同样重要的是翻转交换机并关闭CRISPR活动的方法。关闭CRISPR活动的能力是朝着基于CRISPR的疗法和更精确的编辑在实验室中的重要一步。


参考

东D,郭M,王S,朱y,王S,Xiong Z,杨杰,徐Z,黄Z(2017)抗克切者蛋白抑制Crisp-Spycas9的结构基础。自然546:436-439。https://doi.org/10.1038/nature22377

Harrington LB, Doxzen KW, Ma E, Liu J-J, Knott GJ, Edraki A, Garcia B, Amrani N, Chen JS, Cofsky JC, Kranzusch PJ, Sontheimer EJ, Davidson AR, Maxwell KL, Doudna JA (2017) A Broad-Spectrum Inhibitor of CRISPR-Cas9. Cell 170:1224-1233.e15 .https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.07.037

Li C,Psatha N,Gil S,Wang H,Papayannopoulou T,Lieber A(2018)HDAD5 / 35 ++表达抗CRISPR肽的腺病毒载体降低了人造造血干细胞中的CRISPR / CAS9毒性。分子疗法 - 方法和临床发展9:390-401。https://doi.org/10.1016/j.omtm.2018.04.008

Marino Nd,Pinilla-Redondo R,Csörgőb,邦迪 - 尼斯j(2020)防克隆蛋白应用:Crispr-Cas技术的自然制动器。NAT方法17:471-479。https://doi.org/10.1038/s41592-020-0771-6

Mayo-muñozd,何F,JørgensenJ,Madsen P,Bhoobalan-Chitty Y,Peng X(2018)抗克隆和Crispr的基因组编辑Sulfolobus isliScus棒状病毒2.病毒10:695。https://doi.org/10.3390/v10120695

Pawluk A,Amrani N,Zhang Y,Garcia B,Hidalgo-Reyes Y,Lee J,Edraki A,Shah M,Sontheimer EJ,Maxwell KL,Davidson AR(2016)自然地发生了CRISPR-CAS9的开关。细胞167:1829-1838.E9。https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.11.017

Shin J,Jiang F,Liu J-J,Bray NL,Rauch Bj,Baik Sh,Nogales E,Nogy-Denomy J,Corn JE,Doudna Ja(2017)通过抗CRISPR DNA模仿抗CAS9。SCI ADV 3:E1701620。https://doi.org/10.1126/sciadv.1701620

addgene博客上的其他资源伟德体育中心

addgene.org的资源

其他环节

话题:克里普尔克CRISPR 101.

发表评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅