CRISPR 101:抗CRISPR蛋白关闭CRISPR- cas系统

由贝丝学会主席

最初发布于2017年5月23日,最后由Jennifer Tsang于2020年7月23日更新。云顶娱乐 韦德国际

antirispr就像一个开关CRISPR-Cas技术在不断发展。Cas蛋白的变体可用于基因组编辑激活基因表达抑制基因的表达,.但是还缺少一件事:一种关闭Cas活动的方法。值得关注的是Cas在细胞中保持活跃的时间越长,发生脱靶编辑的机会就越大。尽管方法来打开Cas活动使用药物的发展,该领域缺乏Cas蛋白的“开关”。

发现抗crispr蛋白

也就是说,直到发现抗crispr蛋白2012年(Bondy-Denomy et al., 2012)。抗crispr (Acr)蛋白是噬菌体衍生的CRISPR-Cas系统的小蛋白抑制剂,帮助噬菌体逃避细菌的CRISPR-Cas免疫系统。这些Acr蛋白质最初是在I型CRISPR-Cas系统

四年后Sontheimer戴维森实验室发现三抗crisprs用于II型系统脑膜炎奈瑟氏菌(Nme) (Pawluk等人,2016)。虽然化脓性链球菌Cas9 (SpyCas9)是使用最多、研究最充分的CRISPR系统,脑膜炎奈瑟菌也可用于基因组编辑。在这项研究中,实验室发现抗crispr抑制Cas9活性在HEK293中减少编辑从控制样本的~30%到Acr样本的0-10%。Acr蛋白也可以用来防止dCas9与DNA的结合。

自从这些早期的抗crispr研究以来,科学家已经发现了50多种抗crispr蛋白与CRISPR-Cas系统交互的cas3、Cas9、Cas12、Cas13级联(Marino等人,2020年)。一些Acr蛋白针对特定的Cas蛋白,而另一些可以抑制来自多种细菌的CRISPR酶。

关于反crispr命名的注释

Acr家族蛋白质以类型的CRISPR-Cas系统,它们阻塞并按发现顺序编号(Bondy-Denomy等,2018)。例如,上面提到的AcrIIA4表明它是发现的第四个阻断II-A型CRISPR-Cas系统的Acr蛋白。完整的Acr蛋白列表,按照它们所阻断的CRISPR-Cas系统的类型排列可以在这里找到

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抗crispr蛋白是如何工作的?

抗CRISPR蛋白非常多样化,但大多数阻断CRISPR活性的方式有三种:

  1. 抑制DNA结合
    1. 例如:AcrIIA4阻塞Cas9与PAM站点的交互(Dong et al., 2017),和acri3导致Cas蛋白二聚体阻断PAM识别位点(哈林顿等,2017)。
  2. 抑制crRNA加载
    1. 例如:与Cas9交互的AcrIIC2会干扰和阻止crRNA-Cas复合体的正确组装(Zhu等,2019)。
  3. 抑制DNA乳沟
    1. 例如:AcrIIC1与Cas9的HNH内切酶结构域结合,防止目标DNA裂解(Harrington et al., 2017)。
图示Cas蛋白和gRNA形成复合体,结合DNA,切割DNA。每一步都有抗crispr蛋白的例子,它们可以抑制每一步
图1:抗CRISPR蛋白(Acr’s)可以通过多种方式阻断CRISPR活性,如抑制crRNA装载、抑制DNA结合或抑制DNA裂解。

在你的实验中使用抗crispr蛋白

减少非目标效应

延长Cas活动可以增加脱靶编辑的机会,特别是在大多数脱靶编辑已经发生之后。抗crispr蛋白可以用来限制这种脱靶编辑,但是什么时候是关闭Cas活性的最佳时机呢?利用缓蚀剂定时实验,得到Doudna实验室发现至少50%的Cas9目标编辑发生在前六个小时内。在Cas9 RNPs导入6小时后,将其添加到人类细胞中减少了脱靶编辑,同时仍然允许对目标编辑(Shin等人,2017)。

Acrs也可以用来减少偏离目标的编辑基本编辑,将一个核苷酸碱基对转化为另一个碱基对。

对CRISPR活动的时间、空间或条件控制

通过诱导启动子、光或小分子调控Acr蛋白可以实现对CRISPR-Cas活性的快速、动态和空间控制。例如,融合AcrA4II到光敏LOV2域允许反crispr活动蓝光控制(Bubeck等人,2018)。

减少组织中CRISPR-Cas编辑的细胞毒性

Acr蛋白的小尺寸(约50-200个氨基酸)意味着它们可以被递送在活的有机体内使用AAV载体.有办法关闭CRISPR-Cas系统防止脱靶效应和细胞毒性这是组织中过度核酸酶活性的结果(Li et al., 2018)。

工程病毒时的选择标记

Acr基因可作为工程病毒的阳性选择标记。例如,一个Acr基因被用来替代难以工程的岛状沙锥状病毒2的基因(Mayo-Muñoz等,2018)。只有基因缺失的病毒粒子才能在受到病毒攻击时进行复制美国islandicusCRISPR-Cas系统。

噬菌体疗法

噬菌体疗法使用噬菌体治疗细菌感染,作为抗生素的替代品。但由于许多细菌病原体拥有CRISPR-Cas系统,噬菌体治疗可能没有那么有效。这就是Acr蛋白质发挥作用的地方。Acr蛋白足够小,可以被设计成“保护”治疗性噬菌体,以保护它们免受致病菌的CRISPR-Cas系统的伤害。

结论

CRISPR是进行基因组编辑的好方法。但是,同样重要的是如何打开开关,关闭CRISPR活动。关闭CRISPR活动的能力是朝着基于CRISPR的疗法和在实验室进行更精确编辑的方向迈出的重要一步。


参考文献

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