用MOX FPS避免荧光蛋白融合的黑暗面

客人的博客

本文由客座博主Erik L. Snapp和Lindsey M. Costantini贡献。

“你低估了黑暗面的力量。”

——《绝地归来》中的达斯·维德

当维德提到神秘的邪恶一面时,“此报价同样适用于许多显微镜实验伟德2021足球欧洲杯买球平台(FPS)本地化为除细胞质以外的隔间。这是,不幸的是,一些调查人员意识到他们对暗,非荧光和错误的FP-Fusions对定量成像实验和细胞生理学的影响令人意识到。

下载荧光蛋白101电子书伟德2021足球欧洲杯买球平台 荧光蛋白融合的陷阱

克隆FP融合后第一次观察明亮的信号,因为您喜爱的兴趣蛋白质是令人兴奋和奖励。但是,如果与常规内质网(ER)蛋白质掺入细胞质的FP融合是什么?或者更令人不安,如果融合蛋白分子的显着分数不能正确折叠何种很大程度量?错误折叠的fps不发荧光。黑暗群体不容易明显,并且可以混淆定量成像实验或甚至产生负面影响细胞(参见图1)。

荧光蛋白质错误折叠和二硫键形成导致无官能荧光蛋白

行权时,FPS使研究人员能够调查活细胞中荧光蛋白融合的定位和动态实时。之前,我们已经描述了一些在决定在融合构造中放置FP时应该考虑的实际考虑[1,2],即对靶向靶向序列的FP序列定位,其通常具有绝对位置要求。例如,kdel检索序列仅在极端c-terminus上的函数[3.]。因此,您必须确定您的克隆策略并根据你的实验需要决定是创建N端还是c端核聚变。

同样重要的是,在克隆之前,你必须考虑你的FP是否会在其本地化的环境中发挥作用,以及它的功能如何。4]。大多数研究人员感到惊讶地认为FPS通常适用于除细胞质以外的蜂窝隔室。通常,FPS进化或被设计用于细胞质环境。然而,大约40%的人(和大多数真核)蛋白质定位为化学截然不同亚细胞的环境,包括构成分泌通路的细胞器、内吞囊泡、线粒体、溶酶体或它们被分泌到细胞外环境。许多驻留在这些隔间内的蛋白质都经历了重要的翻译后修饰,包括糖基化、二硫键形成和蛋白裂解。定位于细胞器的FPs同样容易受到这些非天然修饰的影响,这些修饰都可能影响功能[5]。我们和其他人已经报道了FP半胱氨酸残基在分泌途径中形成不恰当的二硫键(图1)[4,6- - - - - -8]。另外,通过添加n-glycans来修饰编码N-糖基化共有序列的FPS [9]。这两种后期修饰都可以破坏折叠蛋白质非荧光的FP折叠。

不幸的是,积累的错误折叠和非功能(暗)荧光蛋白不能被忽视。伟德2021足球欧洲杯买球平台它们有可能干扰常驻ER伴侣的功能,并可能影响细胞功能或生存能力。FP错误折叠甚至会破坏融合蛋白的定位。例如,FPs之间不恰当的链间二硫键的形成阻碍了高尔基复合物局部融合的正确退出ER和荧光(见图2)[5]。当使用含有两个半胱氨酸残基和一个旨在将它们定位于分泌途径的序列的FPs时,免疫荧光可以检测到一个错定位于内质网的暗池。这种暗融合很可能被错误折叠,阻断了分泌途径的进行,并保留在ER中。

FPS是无可否认的强大和成功的工具,使得能够使许多细胞生物学测定。然而,已经存在普遍的观点,即细胞中的大多数FPS将折叠并且荧光模式相当于FP融合蛋白的分布。我们的学习和他人的研究(5,6,7,10,11)突出显示错误的暗FP融合的非常实际后果,包括融合蛋白水平的错误定量。仍然不清楚FP错误折叠是否会影响融合蛋白功能,这可能导致融合蛋白活性的低估和高估。我们鼓励调查人员在功能上表征FP融合蛋白相对于未标记的感兴趣的蛋白质。为避免在您的实验中积累深色荧光蛋白,请考虑以下内容:伟德2021足球欧洲杯买球平台

如何确保使用非细胞溶胶蛋白的FP融合正常?

高尔基复合体中的mOX GFP我们建议使用新发布的开始FPS的氧化优化调色板(MOXFPS)(5]。MOXFPS克服了流行荧光蛋白的固有问题,通过在流行的FPS中突变半胱氨酸残基和N-糖基化共有序列来重新设伟德2021足球欧洲杯买球平台计。这产生了惰性的调色板绿色,青色,黄色的, 和蓝色的可以在各种组合中使用的变体。例如,使用标准的荧光显微镜滤光片,用户可以用绿色和蓝色或青色和黄色的moxFPs组合标记多个感兴趣的蛋白质。moxFPs的固有亮度和光谱特性与未优化的亲本蛋白相当。我们最近的出版物说明当使用优化的moxFP相对于标准FPs时,荧光信号的定量增加。信号的增加并不是因为FP更亮,而是因为大部分(如果不是全部的话)FP融合正确的折叠和荧光团的形成。

我们的MoxFP目前代表了在包括分泌途径(图2),线粒体和叶绿体的内膜空间,细胞外环境和革兰氏阴性细菌周装的各种细胞室中成像的最惰性解决方案之一。努力标记使用CRISPR的这些隔室内蛋白质的内源基因由于上面列出的原因,系统应该强烈考虑使用标准FPS的Moxfps。此外,由于MOXFPS是高度单体的,它们是具有整体膜蛋白和膜相关蛋白(即GPI锚定蛋白)的融合的绝佳选择,这更容易受到许多标准FPS的低聚作用。Moxfps现在可以通过addgene获得


非常感谢我们的客人博客埃里克L.Snapp和Lindsey M. Costantini!

埃里克·李SnappErik Lee Snapp在俄勒冈州卫生科学大学的分子微生物学和免疫学中获得了他的博士学位,他的博士后奖学金与詹妮弗·莱宾·施瓦茨(Jennifer Lippincott-Schwartz)是国家卫生研究院,他目前是Albert Einstein医学院副教授在解剖学系和结构生物学。他的兴趣包括内质网和活细胞成像方法中分泌蛋白质的质量控制。Erik也是狂热的长途跑步者,加德纳和厨师。


林赛CostantiniLindsey M. Costantini从Albert爱因斯坦医学院获得了她的生物医学研究博士学位。她的博士研究是在Erik Lee Snapp的实验室进行的,专注于优化亚细胞环境的荧光蛋白。伟德2021足球欧洲杯买球平台目前,她是北卡罗来纳大学的北卡罗来纳大学的尖顶博士博物馆。在共同委员会盛开的达巴尼亚和杰克格里菲斯,她的研究重点介绍了Kaposi的肉瘤相关的Herpesvirus的复制机械。

参考

1.Snapp,Erik。“细胞生物学中荧光融合蛋白的设计与使用。”细胞生物学的当前方案(2005):21-4。PubmedPMID: 18228466。公共医学中心PMCID:PMC2875081.

2.Snapp,Erik Lee。“伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光蛋白:细胞生物学家的用户指南。”细胞生物学的发展趋势19.11(2009):649-655。PubmedPMID:19819147.。公共医学中心PMCID:PMC2784028.

3.门罗,肖恩和h。r。佩勒姆。使用肽标签来检测克隆基因表达的蛋白质:果蝇hsp70功能域的缺失定位盟军杂志3.13(1984): 3087。PubmedPMID:6526011。公共医学中心PMCID:PMC557822

4.Costantini,Lindsey M.和Erik Lee Snapp。“伟德2021足球欧洲杯买球平台细胞细胞器中的荧光蛋白:严重的陷阱和一些解决方案。”DNA和细胞生物学32.11(2013): 622 - 627。PubmedPMID:23971632。公共医学中心PMCID:PMC3806368

5.Costantini, Lindsey M,等。“针对多种细胞环境优化的荧光伟德2021足球欧洲杯买球平台蛋白的调色板。”自然通讯6(2015)。PubmedPMID:26158227。PubMed Central Pmcid:PMC4499870。

6.JAIN, R,等。“内分泌细胞分泌途径中绿色荧光蛋白的寡聚化。”生物学习。j360(2001):645-649。PubmedPMID:11736655。公共医学中心PMCID:PMC1222268

7.Aronson, Deborah E, Lindsey M. Costantini和Erik L. Snapp。"超级文件夹GFP在氧化环境中会发出荧光当被Sec translocon锁定时"交通12.5(2011):543-548。PubmedPMID:21255213。公共医学中心PMCID:PMC3079558

8.铃木、高久等。“用于氧化环境的无半胱氨酸荧光蛋白的发展。”伟德2021足球欧洲杯买球平台《公共科学图书馆•综合》7.5(2012):E37551。PubmedPMID:22649538。公共医学中心PMCID: PMC3359384

9.Costantini, Lindsey M,等。无半胱氨酸非糖基化蓝色荧光单体蛋白secBFP2,用于真核分泌途径的研究生物化学和生物物理研究通信430.3(2013): 1114 - 1119。PubmedPMID:23257162。公共医学中心PMCID:PMC3552020

10。Paladino,Simona,等。“蛋白质寡聚化调节GPI锚定蛋白的筏分配和顶端分选。”细胞生物学杂志167.4(2004): 699 - 709。PubmedPMID:15557121公共医学中心PMCID:PMC2172584

11. Jokitalo,Eija等人。“Golgi集群和囊泡独立于内质网的介导遗传。”细胞生物学杂志154.2(2001):317-330。PubmedPMID:11470821。公共医学中心PMCID:PMC2150754

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