返回细菌:使用TRNA的CRISPR GRNA复用

由玛丽传动装置

玛丽传动

在它发展的短短时间里,CRISPR / CAS9基因组编辑已被用于研究体内外基因敲除的效果,以及通过同源重组插入目标突变。为了进一步提高CRISPR/Cas9的实用性,有必要提高其复用能力。由于生物通路的自然冗余性,多路复用是关键;为了观察一个表型,常常需要对多个基因进行修饰。

指南RNA(GRNA)通常包装在包含RNA POL III启动子,GRNA和POL III终止子的400-500 BP盒中。这些相对较大的盒子(考虑到GRNA本身是〜100个碱基)限制可以在单个载体中包装在一起的GRNA的数量。此外,POL III启动子相对较弱,并且来自这些构建体的GRNA的低表达可以降低基因组编辑效率。

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一个之前的策略多路聚合gRNAs使用RNA核酸酶Csy4铜绿假单胞菌将4个GRNA分开,由28个基础CSY4识别位点分离,来自多函数转录位点。虽然这种方法缩短了构造尺寸,但它需要CS9和多函数转录的CSY4的共表达。由于核酸酶可能具有脱靶效应和/或毒性,因此使用预先存在的保守的蜂窝机械来处理GRNA是有利的。

劫持tRNA过程来制造gRNAs

在最近发表的论文中,Yinong杨的组这只是他们在水稻上CRISPR工作的一部分。杨对存在于几乎所有生物体中的tRNA处理机制很感兴趣。真核生物的前体或前tRNAs被RNase P和Z(细菌中的E)剪切,只有少数tRNAs元素需要识别和剪切。这一序列的灵活性表明gRNAs可以被纳入这些结构而不影响裂解效率。此外,tRNAs包含内部转录元件,可增强pol III转录,潜在地增加gRNA表达水平。由于trna是细胞中最丰富的分子之一,这个系统显然也足够强大,以确保高水平的gRNA分裂。

Xie等以tRNA-gRNA和tRNA-gRNA- trna的形式构建了多顺反子甘氨酸tRNA-gRNA基因(PTGs),在gRNA之前有较短的5 '间隔序列,以检测gRNA的切割。gRNAs被精确地剪切,没有在5 '间隔上添加核苷酸。在tRNA- grna结构中,3 '端有一个1-7碱基poly(U)尾巴,或者在tRNA- grna -tRNA结构中有一个1-4碱基尾巴。具有任何5 '引导核苷酸的gRNAs都可以被加工,这与其他偏爱5 '端某些核苷酸的方法相比具有明显的优势。

多路复用CRISPR gRNA tRNA盒组织。剪刀表示卵裂的位置。

PTG构造示意图。剪刀表示卵裂的位置。

在确认gRNA裂解后,他们检测了水稻原生质体中两个PTG构建物的gRNA表达水平和indel生成。PTG1和PTG2的转录水平分别是传统grna表达载体的3倍和31倍。在水稻原生质体中,Xie等人观察到的突变率略高于他们之前报道的原生质体(15%和9%的目标位点)。

Cas9修改了多少个位置?

为了测试该系统在gRNA多路复用中的应用,Xie等人再次利用水稻原生质体构建了包含8个gRNA的靶向4个MAPK基因的PTGs。每对gRNAs的目标位点在350-750 bp之间,允许他们检查两个indels在每个位点的频率,以及大缺失。他们在4个位点检测到片段缺失的频率为4-20%,表明Cas9可以被引导到至少8个不同的位点。

他们还在完整的水稻植物中检查了编辑效率,比较了传统的GRNA构建体与PTGS。在含有两个GRNA的PTG构建体中,它们在靶标(35%和76%的双层)上发现了100%的诱导频率,与使用标准单GRNA构建体相比仅为44%和66%的诱导频率。当测试具有五个GRNA的PTG构建体时,他们发现50%的植物在所有五个基因座上有双曲突变。这种高效的多路复用进一步说明了PTGS的潜力。

PTGS的应用

PTG系统的主要优点是其普遍性;鲁棒和有效的TRNA加工是原核生物和真核生物的常见。虽然谢Et制造的质粒。Al专门为植物表达设计,PTG可能适应许多不同的生物系统。虽然谢等。A1以植物的特征为特征,PTG在许多不同的生物系统中可能会很好地工作。大小也是一个因素;POL LLL启动子和终结者只需要一次编码一次,每个<200bp tRNA-GRNA占据标准POL III-GRNA的一半空间,这将促进封装能力有限的系统中的CRISPR / CAS9复用。

还对各种tRNA表达策略感到困惑吗?不用担心,我在下面的图表中总结了这三种策略——包括一些简单的比较。

三种不同多路复用GRNA表达策略的比较:标准POL III GRNA堆叠,CSY-4可切割盒和PTG盒。

PTGS提供的易于复用将改善CRISPR / CAS9在研究的新途径中的效用。靶向单个基因的多个GRNA可以增加基因敲除的可能性,或者可以使用多种GRNA来靶向具有重叠活性的基因。多个GRNA还可以促进其他地区的缺失,例如非划分的RNA或监管元素,以检查其功能。细菌和病毒已经说明了多顺声基因组织的力量,其与CRISPR / CAS9的翻译显示了多重基因组编辑的巨大潜力。

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参考

  • 利用内源性trna处理系统增强CRISPR/Cas9的多路编辑能力。谢凯,闵肯伯格,杨勇,等。2015年3月17日中国国家科学研究院学报(自然科学版);doi: 10.1073 / pnas.1420294112。Epub 2015年3月2日PubMed.

其他gRNA多路复用技术

  • 用综合RNA和CRISPR / CAS工具包在人体细胞中复用和可编程调节。Nissim L,Perli SD,弗里金A,Perez-Pinera P,Lu TK。Mol细胞。2014年5月22日; 54(4):698-710。DOI:10.1016 / J.MOLCE.2014.04.022。2014年5月15日。PubMed.
  • 二聚体CRISPR rna引导的FokI核酸酶用于高度特异性的基因组编辑。蔡圣贤、威威肯斯、卡伊特、福登、塔帕尔V、雷永D、古德温MJ、阿尔耶MJ、荣格JK。生物技术。2014年6月;32(6):569-76。doi: 10.1038 / nbt.2908。Epub 2014年4月25日。PubMed.

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