通过化学和小分子荧光团更好地染色

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这篇文章由客座博主,卢克拉维斯是Janelia Research Campus,Howard Hughes医学院的团队领导者。

化学已经死了,长期存在的化学!

的发现绿色荧光蛋白(GFP)引发了生物成像的文艺复兴。突然,细胞生物学家不再被拒绝化学家和(昂贵的)合成荧光团。添加带电动摇晃的DNA划痕,电池变得完美地能够自己合成荧光团融合。随后的进步伟德2021足球欧洲杯买球平台一旦排斥小分子,已经复制了许多属性:红移光谱离子敏感性拍摄等等。这些令人印象深刻的进步导致了一个明显的问题:在这个GFP和其ILK的这个时代,为什么细胞生物学家应该与化学家交谈?

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一个原因是称为“光子预算”的东西:每个样品具有有限数量的荧光团,并且每种荧光团可以在漂白之前发射有限数量的光子。可以从生物样品中提取的信息量完全取决于光子预算并推动荧光显微镜的前沿通常需要更多的光子。例如,从蛋白质融合到基因编辑细胞的瞬时过表达移动可以降低荧光团的数量,损害光子预算。同样地,从集合成像到单分子成像的切换会使光子预算更大负担,这决定了我们可以跟踪单个分子的长度和精确。差的光子预算是一种荧光蛋白的广泛问题 - 即使是第三款最新的细胞生物学家也可以像一个大学生寻找沙伟德2021足球欧洲杯买球平台发垫进行备用变化,绝望地提取来自样品的更多光子。

化学荧光团可以基本上比荧光蛋白更亮,更光稳定,提供了改善光子预算的直接途径。伟德2021足球欧洲杯买球平台当然,“恢复”到小分子染料似乎令人生畏 - 没有人想要将他们的日子微观的荧光缀合物分成细胞。幸运的是,在过去的20年里,巧妙的化学家和生物化学师已经开发了在诸如活细胞和组织之类的复杂生物环境中更容易和更有效的技术(图1)。这些灵活的策略为您提供了最佳世界:化学染料的优秀光药结合荧光蛋白的易于和特异性。伟德2021足球欧洲杯买球平台

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细胞内标签策略

大多数的细胞内标记策略有两个部分:(1)一个基因编码的“标签”表达为与你最喜欢的蛋白质的融合(2)一个合成的含荧光团的“配体”与标签结合。像大多数生物成像的好主意一样,细胞内标记技术的最初突破是由Roger Tsien.据据表明,双半染料配体(例如,闪光,reah)和短遗传编码的四环素之间的选择性相互作用(Cys4.)肽标签可用于标记细胞中的蛋白质(图1A)。根据这一概念制定的其他战略包括:

  • 自我标签标记(例如,Snap-Tag.HaloTagTMP标签) -这些广泛使用的系统由一个基因编码的酶变异标签组成,该标签与一个附着在荧光团上的小底物配体基序发生特异性和不可逆反应(图1b)。
  • 工程连接如硫辛酸连接酶、生物素连接酶、磷酰乙酰转移酶等) -这些酶催化荧光团配体与肽标签的共价连接(图1c)。
  • 点击化学(例如,跨环辛烯-四嗪)- 非天然氨基酸可以掺入蛋白质结构中,然后与生物正交化学反应的生长工具箱(即,点击化学)一起使用,以在掺入的特定位点附着荧光团(图1D)。
  • 荧光激活蛋白(FAPS)-这些修饰的抗体片段结合并增强小分子荧光素(图1e)。
  • 污渍- 这些标签由与具有高亲和力缀合的荧光团,其对内源性分子靶标如紫杉醇。与其他系统不同,没有基因编码的标签是作为内源蛋白的小分子结合基序(图1f)。

活细胞标记策略

标签策略的利弊

所有这些标签策略在遗传编码标签的大小,荧光团附件的速度和选择性之间具有权衡的权衡,所得缀合物的亮度和系统的复杂性。对小分子标记策略的一种特别理想的性质是荧光性,意味着配体在溶液中自由表现出低荧光,但是在与其同源蛋白结合时高荧光。在某些情况下,该属性消除了从样品中去除过量染料的需要,这对于难以难以造成诸如完整组织的样品尤其重要。一些化学标记策略,如双石管染料(图1A)和FAP系统(图1E)是固有的荧光,并且可以使用环境敏感的荧光团制成荧光的几种。总的来说,自我标记标签系统(图1B)可能是活细胞标记的最佳方法,并且鉴于系统的相对简单性和荧光和荧光配体的可用性,来自荧光蛋白的最简单的开关。伟德2021足球欧洲杯买球平台

新的荧光团

作为这些创新标签策略的必然结果,包括我的团队在内的几个团队一直在重新使用染料的旧化学方法。第一个合成染料,淡紫色,是1856年发现的威廉·帕金。他的发现掀起了一系列活性和大多数经典的小分子荧光团,例如罗丹明(图2a),在19中被发现TH.世纪。由于其建立的化学,小尺寸,亮度和细胞渗透性,许多小分子标记技术集中于这种经典,网中性染料支架。在过去的几十年中,对该已建立的染料结构的进一步改进已经产生了先进的罗丹明荧光团的商业面板,例如Alexa Fluor和Atto染料,具有改善的亮度,光稳定性和光谱范围。然而,这些荧光团被设计为用于固定细胞成像的抗体和寡核苷酸标记,而不是用于活细胞应用。因此,这些荧光团通常是笨重的并且含有极性基团(图2b),这可以妨碍其在活细胞内部。我们最近发现,掺入四元偶氮环环可以显着提高经典罗丹明和它们的类似物的亮度和光稳定性,而不会牺牲它们的小尺寸和膜渗透率(图2c)。这些细胞可渗透的Janelia Fluor(JF)染料在活细胞内具有优异的性能,特别是对于先进的成像实验。我们继续开发具有不同光谱性质的衍生物,表现出高荧光性,是可光敏的,并且功能体内. *

小分子荧光团

最终的想法

荧光蛋白的易用性和持续改善使它们成为许多(如果不是大多数)荧光显微镜实验的去选择。伟德2021足球欧洲杯买球平台但是,当您的预算有点薄,小分子标记方法可以为您的成像实验提供新鲜的光子输注。创新的标签策略和改善的荧光团正在制作化学染料,细胞生物学家越来越有吸引力,并且我们还没有完成。进一步改进这些系统 - 较小的标签,更亮的缀合物,更高的荧光性,光活化等 - 可以进一步增加光子预算并允许我们进一步推动生物成像的前沿。

*担心你的预算?电子邮件Janeliafluor@janelia.hmi.org.试试JF染料。


致谢

我感谢Brett Mens,这是一个幸运的士兵,有用的评论。

非常感谢我们的客人博主,卢克D. Lavis!本博文中的所有图像由Luke D. Lavis贡献。

卢克拉维斯爆头Luke D. Lavis目前是Janelia Research Campus,Howard Hughes Medical Institute的一团领导者。他宁愿在实验室中为先进的成像方式制作新的荧光团。跟着他在推特上@ rhodamine110

参考文献

1。刘,哲,卢克D. Lavis和Eric Betzig。“在单分子水平上成像活细胞动态和结构。”分子细胞58.4(2015):644-659。PubMed.PMID:26000849

2。Grimm,Jonathan B.等人。“一种改善活细胞和单分子显微镜荧光团的一般方法。”自然方法12.3(2015): 244 - 250。PubMed.PMID: 25599551。pmed中央PMCID: PMC4344395

3。Lavis,Luke D.和Ronald T. Raines。“化学生物学的明亮理念。”ACS化学生物学3.3(2008):142-155。PubMed.PMID: 18355003。pmed中央PMCID: PMC2802578

4。薛林等。“通过共价标记成像和操纵活细胞中的蛋白质。”自然化学生物学11.12(2015):917-923。PubMed.PMID: 26575238

5。Crivat,Georgeta和Justin W. Taraska。“具有荧光标签的细胞内的成像蛋白。”生物技术的趋势30.1(2012):8-16。PubMed.PMID:21924508。pmed中央PMCID:PMC3246539.

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