利用CRISPR多路捕获启动子增强子3D染色质结构

由Beth Kenkel.

最初发布于2017年12月7日,并于2020年7月2日更新。

启动子可能是基因调控的明星,但增强子和染色质环起着重要的辅助作用。增强子是顺式调控的DNA序列,当与转录因子结合时,可以增加基因的转录。有时增强子的位置与它们所调控的基因相距数千个碱基对,但染色质(形成染色体的DNA和蛋白质的复合体)的环使增强子靠近。

这些长程DNA相互作用通常用基于染色体构象捕获(3C)的方法,如5C或Hi-C (Han等,2018)。将3C方法看作是通过分析DNA测序数据“发展”出的照片来获取染色质循环的快照。虽然用目前的3C方法生成的“图片”提供了染色质相互作用的有用信息,但它们是颗粒状的,所以很难弄清楚细节。为了增加分辨率,这个徐实验室创建了一个基于dcas9的CAPTURE (CRISPR Affinity纯化原位管制要素)方法。最初的CAPTURE方法于2017年发布解决了3C方法的许多缺陷,但一次只能检测基因组中一个位置的染色质相互作用(Liu et al., 2017)。最近徐实验室发展起来捕捉2.0这是一种更新版的捕获技术,可以同时检测数百个位点上的染色质相互作用(Liu et al., 2020)。

调控元件原位CRISPR亲和纯化:原始的CAPTURE方法

原始的CAPTURE方法需要创建一个稳定的细胞系,共同表达三个成分:

  1. dCas9,添加生物素受体位点
  2. Bira,一种生物素连接酶
  3. 瞄准单个基因组位置的gRNA(s)

当这三种成分共同表达时,gRNA将dCas9定位到目标位点,而dCas9被BirA生物素化。由此看来,CAPTURE方法类似于其他3C方法:交联捕获染色质相互作用,限制性内切酶将DNA切成更小的片段,近距离连接创建DNA的嵌合环,它们线性距离遥远,但在空间上紧密相连。然后,通过PCR或下一代测序检测这些嵌合DNA片段,就可以得到染色质“图片”。

CAPTUREworkflow
图1:CAPTURE方法的关键步骤的概述。蛋白质和DNA复合体交联后,DNA被消化成更小的片段。粘末端被连接在一起,形成DNA环。这是连接DNA片段的关键这些片段在碱基对上相距遥远,但在物理位置上相距很近。然后DNA被剪切成足够小的片段,通过链霉亲和素IP将其拉下来。生物素化的dCas9贯穿了所有这些步骤,直到它与DNA的连接在交联反转过程中中断(图中没有显示)。交联是反向的,因此DNA片段可以通过PCR或深测序检测。

原来的CAPTURE方法的一个缺点是必须为每个感兴趣的基因组位点创建一个新的细胞系。由于不同的CAPTURE细胞系具有不同水平的dCas9和gRNA表达,所以这很麻烦,也使得在多个靶点之间比较结果变得困难。另外,基于CAPTURE 3c的测序需要大量的细胞(~5x107)。这两个要求一起阻止了对原代细胞或稀有细胞群使用CAPTURE。

CAPTURE 2.0系统的关键组件

为了改进原来的CAPTURE方法,Xu Lab做了以下更改来创建CAPTURE 2.0:

  1. 用biotap标签替换dCas9上的biotinalable标签。BioTAP-tag是一个69 aa长的生物素化靶向序列,可被通常在真核细胞中表达的生物素连接酶识别。使用此标记将需要交付给单元格的CAPTURE组件的数量从3个减少到2个。
  2. biotap标记的dCas9和gRNAs慢病毒传递。使用剩下的两个CAPTURE 2.0组件的慢病毒传递消除了创建稳定细胞系的需要,并允许CAPTURE 2.0与原代细胞一起使用。

为CAPTURE 2.0找到质粒!

与原始的CAPTURE相比,CAPTURE 2.0在特征良好的β球蛋白位点的启动子上的染色质相互作用的捕获率增加了~14倍。两种方法对实验目标DNA序列的特异性率相似。

CAPTURE vs CAPTURE 2.0
图2:比较CAPTURE和CAPTURE 2.0。

原始捕获 捕捉2.0
生物素酰化酶 BirA 内源性生物素连接酶
表达系统 稳定的细胞系表达1)flag -biotin标记的dCas9, 2) BirA,和3)一个或多个gRNAs 两种单独的慢病毒携带1)一个biotap标记的dCas9和一个eGFP标记,以及2)gRNAs
靶向位点的数量 一个 许多
样本类型(年代) 细胞系 细胞系,原代细胞

表1:原始捕获和捕获2.0方法之间的关键差异。

CAPTURE 2.0的应用

捕获2.0检测染色质相互作用的增加率打开门,以回答有关染色质构象的更多问题。XU Lab提出了三种使用捕获2.0的方法:

1.染色质相互作用的多重捕获

XU实验室进行了概念证据实验,表明捕获2.0可以立即检测多种染色质相互作用。用捕获2.0分析富集的β-珠蛋白基因素的五个位点的染色质相互作用,捕获2.0,靶向每个部位的两个GRNA。他们发现,通过GRNA靶向的DNA序列是实验中的富集序列,并且几乎没有富集由阴性对照GRNA或预测的GRNA脱靶位点靶向的DNA。用多路复用捕获2.0识别的远程染色质相互作用大致用原始捕获方法识别的基本复制相互作用。这两种捕获方法都优于其他3D染色质方法,如ChIA-PET或者高c通过增加被识别的染色质相互作用的数量和靶上富集的水平。

2.确定染色质相互作用网络的空间和层次组织

CAPTURE 2.0的第二个应用是构建空间和层次染色质相互作用网络。把这些染色质相互作用的网络看作是一个社会网络。它们可以告诉你哪些增强子与哪些启动子相互作用,增强子喜欢与基因的哪个部分相互作用,以及每个增强子与多少个启动子或基因相互作用。超级增强子是特别好的模型,以建立染色质相互作用网络,因为他们是一个大集群的增强子。CAPTURE 2.0的多路复用和高分辨率使Xu实验室能够同时表征157个超级增强子的“社交网络”。

3.测量染色质相互作用的时间变化

CAPTURE 2.0的第三个应用是检测染色质构象的短暂变化,比如那些发生在发育和细胞分化期间的变化。利用细胞系模型,Xu实验室追踪了红细胞分化过程中增强子-启动子的相互作用。

CAPTURE 2.0捕获染色质在基因调控中的动态作用

捕获2.0产生的高分辨率和多重染色质'照片'允许我们揭示染色质相互作用中的新细节和模式。捕获2.0告诉染色质故事是重要的,但它不是基因调节中唯一的情节线。当染色质构象数据与基因表达的变化进行比较时,我们可以开始建立围绕基因表达的变化的事件的时间表,并确定谁是这些变化的关键驱动因素。通过产生更生动的染色质图片,捕获2.0重新写入基因调节脚本。

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参考

韩静,张哲,王凯。(2018)。基于3C和3C的技术:空间基因组组织解密的强大工具。分子细胞遗传学、11。https://doi.org/10.1186/s13039-018-0368-2

Liu X, Zhang Y, Chen Y, Li M, Zhou F, Li K, Cao H, Ni M, Liu Y, Gu Z, Dickerson KE, Xie S, Hon GC, Xuan Z, Zhang MQ, Shao Z, Xu J (2017) In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9.(生物素化dCas9)细胞170:1028 - 1043。e19。https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.08.003

刘,X,, Y。,,Y。,,Y。,,N, Botten, G.A。曹,H,奥尔金,S.H,张M.Q, &徐j .(2020)。生物素化dCas9多路捕获位点特异性3D染色质的空间配置和时间动态。基因组生物学、21https://doi.org/10.1186/s13059-020-01973-w

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