Casilio:自适应,多任务处理“CRISPR-OS”

客人的博客

这篇帖子由Guest Bloggers Albert Cheng and Mark Wanner提供贡献。

CRISPR-CAS9.为基因组编辑提供了一个飞跃,为研究人员提供了大大提高的准确性、效率和多功能性。它极大地加速了生物医学研究,允许在实验模型系统中以以前难以想象的速度和精度建模人类疾病突变。此外,切除有害突变并引入功能序列的能力正在研究中Dystophin蛋白/ Duchenne肌肉营养不良症此时 - 对一些孟德尔疾病的人类临床护理可能是潜在的转型性。Casilio概述

CRISPR / CAS9的早期应用

尽管如此,由于CRISPR-CAS9一直在实验室和临床应用中的承诺,它最初限制了几个功能。它就像一个早期的智能手机,只有一个单词加工应用程序革命性,而第一个单词,但缺乏除了在基因组中剪切/删除和复制/粘贴以外的任何事情的能力。Cas9核酸酶以通过引入其核酸酶结构域中的突变被改变为核酸酶 - 死Cas9(DCAS9)。DCAS9不再切割DNA,但仍然与指定的基因组序列与引导RNA结合,其用作可编程DNA结合蛋白。DCAS9可以融合到不同的效应蛋白,以在基因组基因座的函数中调解功能,如现在可以运行几个应用程序的智能手机。这种“CISRPR 2.0”的扩展功能包括基因调节表观遗传的编辑,用于成像的DNA标记, 和更多的.CRISPR 2.0的缺点是什么?它一次只能执行一种功能,因为在大多数情况下,效应蛋白直接与dCas9融合。

Casilio启用CRISPR-Cas9组合功能

虽然CRISPR 2.0已经证明对研究非常有用,但基因不在分离中工作,并研究基因网络和涉及跨多种基因功能障碍的复杂疾病需要更高的功能。这将我们带来了我们认为Crispr 3.0:Casilio.Casilio是一个强大的平台,允许CRISPR/Cas9进行多任务处理,轻松采用新功能,就像一款尖端智能手机,可以同时运行多个应用程序,并可以从不断增长的应用程序集合中安装新的应用程序。它是一个混合构建的CRISPR-dCas9和效应子融合到可编程的Pumilio (PUF) rna结合域。PUF结构域包含8个序列重复,每个重复通过改变两个特定的氨基酸双残基来识别四个RNA碱基中的一个。在Casilio中,dCas9充当一个钳夹,将经过修饰的gRNA结合到你感兴趣的基因组区域(即“Casilio模块”)。因为你几乎可以通过4个puf效应模块中的任何一个来招募不同的puf效应模块8Pumilio序列,Casilio使用单个DCAS9和PUF效应模块的可扩展库实现多种功能。

Casilio应用程序

使用Casilio所需的组件是dCas9 (pAC1445或现有的dCas9表达载体addgene.org.;至少一个sgRNA-PBS(附加到一个或多个Pumilio结合位点的单向导rna);Casilio模块(融合蛋白由效应结构域融合到PUF结构域组成,该结构域可识别特定的8-nt Pumilio结合位点)。为了帮助其他人开始探索卡西利奥近乎无限的可能性,我们提供许多模块通过Addgene,包括基因激活、基因抑制、染色体标记(荧光)、组蛋白乙酰转移酶模块、PUF融合克隆载体等(见表1)。

表1:Addgene的Casilio模块

基因激活 基因镇压 表观遗传编辑 染色体标记
pAC1355 PAC1451. pAC1417 pAC1446
pAC1356 pAC1449 pAC1418 pAC1448
pAC1357 pAC1415 pAC1447
pAC1358 pAC1416 PAC1402.
PAC1393 Pac1450 PAC1403.
PAC1392 PAC1404.
pAC1411

Casilio的示例应用

利用Casilio,可以将效应蛋白招募到具有不同数量的八聚体Pumilio结合位点(PBS)的修饰单导RNA (sgRNA-PBS)上。正如我们在我们的开放式纸张Casilio可以在多个基因座中允许精确,同时的基因组操纵复用。在论文中,我们表现出同时激活10.和镇压的SOX2.我们还证明了端粒和着丝粒的双色标记。

另一个强大的潜在应用是化学计量学定义的蛋白质复合物的组装。这使得研究人员能够研究参与基因调控的复合物。通过生成Casilio模块和使用附加在不同数量和类型的Pumilio结合位点上的sgRNAs,将有可能研究包含或排除复合物中特定成分的影响。也可以研究化学计量学对复杂函数的重要性。,recruiting x molecules of component A versus y molecules of component B—and the roles that stoichiometry can play in epigenetic modifications at a target site.

Casilio系统的未来补充

Casilio模块数据库

虽然我们目前的Casilio表达载体用于瞬时转染,但我们提供含有Casilio模块的ORF的网关供体质粒。这些可以被关闭到适合您的单元格或模型系统的任何网关兼容的目标向量中。我们也正在开发Casilio模块(Lenticasilio)的慢病毒表达矢量集合,以便使用Lentivirus易于将Casilio提供给您的细胞类型。Lenticasilio很快将在Addgene提供。我们还将扩展正交Casilio模块的集合和数据库,每个模块都绑定独特的PUF代码。未来的模块将是正交的,允许Casilio模块的即插即用组合用于功能基因组学(见图2)。

我们希望卡西利奥能帮助不同领域的研究人员,并邀请“开发者”在卡西利奥平台上进行构建。有了这个crispr操作系统(CRISPR-OS)的概念,我们希望看到未来的任何基因组研究实验“都有一个卡西利奥”。

有关卡西利奥的更新和更多详情,请访问http://casil.io.Addgene Casilio页面

分享科学刚刚变得更容易...订阅博客


非常感谢我们的嘉宾博主!

程先生

Albert Cheng博士是杰克逊大学的助理教授
基因组医学实验室,研究专注于工程
更好,更强大的方法来调查基因组,表观蛋白酶和
转录组。你可以在Twitter上关注他@Albertwcheng.

马克华纳Mark Wanner(@markgenome在Twitter上)是副主任
在杰克逊实验室的研究通信并写下所有
遗传学和基因组学的方面及其对临床的影响
进步。

参考

1.程,艾伯特W.等。“Casilio:用于基因调控和基因组标记的多功能Cris-9-Pumilio杂交。”细胞研究(2016).PubMedPMID: 26768771.公共医学中心PMCID: PMC4746610

addgene博客上的其他资源伟德体育中心

更多资源请访问Addgene.org

主题:克里普尔克其他CRISPR工具

发表评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅