选择CRISPR核酸酶:网站可访问性,特异性和敏感性

Andrew Hempstead.

2016年1月,我们首先发布了博客职位:我选择哪个CAS9为我的CRISPR实验选择?这三年飞行,但从那以后,科学家们为许多具体的研究需求进行了适应CRISPR核酸余量。在此更新中,我们将专注于最新的进步以及一些这些变体如何适合您的特定研究问题。

选择CAS核酸酶时的考虑因素

在为实验选择CAS9核酸酶时,有三种重要因素需要考虑:现场无障碍,特异性和敏感性。

CAS9目标可访问性取决于CAS蛋白识别的PAM序列站点可访问性

站点可访问性是一种测量,基因组序列可以由Cas9定位。这由核酸酶识别的PAM序列确定。对于最常用的CAS9,SPCAS9来自链球菌Pyogenes,这个序列是3'-ngg。但在其他物种中发现的CAS9可以识别各种不同的PAM序列。研究人员还使用实验演变来开发具有更广泛PAM特异性的CAS9,允许瞄准以前不可用的网站。

特异性

特异性是评估CAS9的偏离目标活动。当Cas9切割一个不是完美匹配的网站时,这可能会发生这种情况指导RNA.(GRNA)用于瞄准感兴趣的基因组轨迹。随着这些偏离目标效应可以是基因组的,并且在某些情况下,难以确定,脱靶切割的可能性应该是任何实验期间的重要考虑因素。

灵敏度

Cas9敏感性通常与特异性密切相关。敏感性是Cas9核酸酶的靶向活动的衡量标准。这可以通过测量目标站点处的indel频率来确定。可以通过计算偏移偏移活动的目标活性来测量特异性比。

CAS特异性衡量偏移目标活动,而CAS敏感度衡量目标活动

CAS9表现出增强现场可访问性的核酸酶

为了在特定位置产生基因组改变,必须通过CAS9访问它。我们以前的博客帖子PAM要求和扩展SPCAS9之外的CRISPR描述了从不同生物中分离的Cas9的PAM特异性工程Cas9变体这能够定位不同的PAM网站(ngg,ngan,ngng,ngag和ngcg)。从那时起,Osamu Nureki实验室描述了一个合理的工程化Cas9,SPCAS9-NG., 哪一个只需要DI-核苷酸PAM NGNishimasu等人。,2018年)。David Liu实验室类似地描述XCAS9.,它显示了靶向多个PAM序列(NG,GAA和GT)的能力,大大增加了可以瞄准的基因组基因座的数量(胡等人。,2018年)。

由于其严格的PAM特异性,这些改变的变体可以允许靶向野生型CAS9可能无法访问的基因组基因座。这对此可能尤为重要基础编辑CAS9必须针对非常特定的部位的技术。

在选择CAS9中使用的特异性与敏感性在您的实验中使用

一个开放式实验室冰箱的漫画,其中具有模型生物,DNA和抽屉,表明CRISPR:CAS中的CAS蛋白。

Crispr抽屉。这么多选择!玛雅·克朗特曼漫画。

选择CAS9时的另一个重要考虑因素是平衡特异性和敏感性。野生型CAS9表现出高的目标活性,但也具有高偏移活动,这可能在许多应用中可能是不希望的。在我们在选择Cas9的第一个博客帖子时,冯张立实验室已描述Espcas9.,而Keith Joung Lab已经发展起来SPCAS9-HF1。两种酶显示相对于Cas9的偏离目标活性降低。从那时起,joung和jennifer doudna实验室使用了目标诱变来产生超准确的cas9(hypacas9.)。该核酸酶显示出在许多不同位点的ESPCAS9和SPCAS9-HF中降低或相似的偏移活性。使用组合随机和定向诱变方法,创建了Anna Cereseto实验室PX-Evocas9.他们表现出的特异性增加。

最近,Jungjoon Lee实验室使用了指向的演变来产生狙击手Cas9.导致CAS9具有改善的特异性。他们将Sniper-Cas9的现场和非现场活动与不同长度的GRNA的不同CAS9变体进行了比较(Lee等,2018)并且发现狙击CAS9在大量基因座和GRNA长度上显示出高度的特异性和灵敏度。

最近的Cas9替代品

虽然Cas9仍然是最广泛使用的Crispr核酸酶,但最近的工作表明,替代酶可能更好地遵守特定的实验方法。一个例子是Casx.,以奥克斯和Doudna实验室为特征,这既小小,又可能引起强烈的免疫应答,可能使其特别适合的因素体内研究和潜在的治疗方法。CAS12B,其特征在于(Strecker等,2019年) 和(Teng等,2018年)实验室也显示了承诺体内由于其相对于Cas9的小尺寸和特异性而导致的研究。由于科学家们不断从各种来源表征Crisprup核酸酶,因此可能对研究人员提供的工具包将继续扩大。

最后的想法

由于首次使用CAS9来工程到基因组,还有越来越多的CA酶和变体可供选择。虽然没有酶是完美的所有实验方法,但了解每个CAS酶的优点和局限都可以有助于确定使用哪种酶。记住,可访问性,特异性和敏感性是为您选择实验的CA蛋白的关键考虑因素。

订阅CRISPR博客帖子


参考

胡,约翰尼H.等人。“具有广泛PAM兼容性和高DNA特异性的Cas9变异。”自然556.7699(2018):57。PUBMEDPMID:29512652。pmed中央PMCID:PMC5951633。

Lee,Jungjoon K.等人。“CRISPR-CAS9的定向演变增加了其特殊性。”自然通信9.1(2018):3048. PUBMEDPMID:30082838.。pmed中央PMCID:PMC6078992.

Nishimasu,Hiroshi等。“具有扩展的瞄准空间的工程克里普尔卡Cas9核酸酶。”科学361.6408(2018):1259-1262。PubMed.PMID:30166441。pmed中央PMCID:PMC6368452。

STRECKER,Jonathan等人。“用于人类基因组编辑的CRISPR-CAS12B的工程。”自然通信10.1(2019):212。PUBMEDPMID:30670702。pmed中央PMCID:PMC6342934

滕,费,等。“重新修复CRISPR-CAS12B用于哺乳动物基因组工程。”细胞发现4.1(2018):63。PUBMEDPMID:30510770。pmed中央PMCID:PMC6255809.

addgene博客上的其他资源伟德体育中心

addgene.org的资源

话题:克里普尔克CAS蛋白

发表评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅