选择B(右)EST荧光蛋白:光稳定性

由Guest Blogger.

这篇职位由Guest Bloggers Joachim Goedhart和Marieke Mastop来自阿姆斯特丹大学的分子细胞学和van Leeuwenhoek中心。

本系列中的前一篇文章描述了一个选择明亮荧光蛋白的实用方法。在本系列的第二个帖子中,我们将讨论如何选择光稳定荧光蛋白

光漂白是在光线影响下的荧光团的不可逆转破坏。任何荧光分子都会在某些时候光漂白。对于活细胞成像,希望具有光稳定的荧光蛋白。伟德2021足球欧洲杯买球平台在光博顶部,荧光蛋白可以显示可逆强度变化(伟德2021足球欧洲杯买球平台Shaner等,2008年;Bindels等,2017)和照片开关(Kremers等,2009年),通常是不希望的性质。在理想的情况下,荧光蛋白应发出稳定的荧光信号,在实验过程中显示出没有或没有的信号的恶化或变化。

用于活细胞成像的最伟德2021足球欧洲杯买球平台佳荧光蛋白可以很多次兴奋,从而在它们被破坏之前产生大量发射的光子。

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影响光稳定性的因素

荧光团的光噬速率主要取决于激发功率和激发波长。当荧光振荡偏离峰值波长时,荧光团不太可能漂白,因为它将更有效地吸收激发光。类似地,降低激发光的功率降低了每单位时间的激发/发射循环的数量,降低荧光团将漂白的可能性。然而,这不是完整的故事。光博砍伐率不依赖于线性方式的激励力。这意味着减少功率2折不会减少光截面一半。迄今取决于功率的究竟究竟是多么的荧光蛋白质。这可以在相同光谱级别中的荧光蛋白(伟德2021足球欧洲杯买球平台Cranfill等,2016年)。

这种非线性依赖性对激励力的依赖性是重要的,因为不同的荧光成像策略使用广泛不同的激励力量(Shaner等,2008年)。在共聚焦激光扫描显微镜中,荧光蛋白质以非常强烈的光(对于短暂的时间)激发,而在伟德2021足球欧洲杯买球平台宽场成像荧光团以相对低的光水平激发(延长时间)。其他照明策略,例如2-光子激励,选择性平面照明,TIRF或纺丝盘共焦使用完全不同的激励功率制度。因此,对于这些条件中的每一个,荧光蛋白最具光稳定性是不可预测的。在这些因素的顶部,蜂窝氧化还原状态和氧浓度等环境条件可能影响光博均衡率(Shaner等,2008年)。这将我们带来了关键问题:比较不同荧光蛋白的光稳定性的最佳方法是什么?伟德2021足球欧洲杯买球平台

测量光稳定性

Photabulity Meruluean.显然,光稳定荧光蛋白是定量活细胞成像的关键要求,重要的是能够量化荧光蛋白的光稳定性。伟德2021足球欧洲杯买球平台为了确定光稳定性,进行实验,从而测量荧光强度。为了预测荧光团如何在“真实实验”中表现,建议在实际条件下进行产生荧光蛋白的细胞的时间延时成像,即具有低励磁功率。通过对不同荧光蛋白的这些测量重复,并通过比较荧光强度随时间变化的变化,可以直接比较荧光蛋白的伟德2021足球欧洲杯买球平台光稳定性。

各种光稳定性测量的示例青色荧光蛋伟德2021足球欧洲杯买球平台白在图1中描绘。值得注意的是,光漂白率不依赖于荧光强度或蛋白质分布。因此,可以用可溶性荧光蛋白或局部融合蛋白进行光稳定性测量,并且不需要专用的质粒或构造。伟德2021足球欧洲杯买球平台

应当注意,文献中报告的光稳定性测量以不同的方式进行。我们描述了一些用于进行这些测量的实验设计的问题,并希望这些信息可以帮助指导您对报告的数据的理解。

光漂白导致荧光损失,其在其最简单的形式中可以通过单指数衰减(类似于放射性衰减)来描述。因此,强度衰减通常由T½描述,这是初始荧光强度仍然存在的一半之后的时间。第一个问题是,在几种情况下,荧光团的荧光强度衰减不遵循简单的单指数衰减(Shaner等,2008年;Bindels等,2017)并且不能通过单个参数来描述。因此,有必要知道荧光强度如何随时间演变。

第二个问题是,在测量光稳定性的实验中,通常使用高励磁功率来减少实验的长度。由于光漂白率与功率线性线性相关时,高功率达到的结论可能不会转化为实际应用,其中使用远更小的功率。例如,您可能会发现,您可以从所选的FP获取有用的数据,比这些高功率实验的预测更长。在现实的功率下测量光稳定性将更好地了解预期应用中的光稳定性(Goedhart等,2012)

第三个问题涉及荧光蛋白的环境。可在纯化的荧光蛋白上进行光稳定性测量。伟德2021足球欧洲杯买球平台为了避免扩散,蛋白质是(i)被捕获在嵌入凝胶中的水/油乳液(II)中的微型电池,或附着在基材上的(iii)。这些体外方法允许受良好控制的环境,但它们不模仿自然情况。测量活细胞中的光稳定性提供了更真实的光稳定性。

选择光稳定蛋白质

光博均衡率的定量问题可以概括如下:而不是在高功率下测量水/油乳液中的荧光蛋白的T 1/2,而是测量荧光强度随着时间的推移在活细胞中的时间流动用于活细胞成像的功率。

为了得出结论,最佳稳定的荧光蛋白可以通过在显微镜系统上的相同光谱类别的几种荧光蛋白的头部比较和旨在与荧光一起使用的细胞型(或组织)来鉴定。伟德2021足球欧洲杯买球平台蛋白质。在图1中,我们提供了使用宽田成像的青色荧光蛋白之间的这种比较的例子。伟德2021足球欧洲杯买球平台我们选择用于活细胞成像的光稳定蛋白质将是mturquoise2.,基于以低励磁功率获取的数据。然而,注意,在14倍的激发功率下,变体的光稳定性是可比的(图1的下图)。

为避免激励力的变化,重要的是在稳定的系统上一天执行实验。最后一项建议是测量您在成像实验中使用的激励动力。衡量激励力量是良好的做法(Glünwald等,2008年)偶尔并且当然已经改变了设置后(例如在更换破碎的电灯泡或交换激发滤波器之后)。这避免了激励功率的大量变化,并有助于保持探针的光稳定性。


非常感谢我们的客人博主JoachimGoedhart.和马里克米斯托克!

joachim goedhart.joachimGoedhart.是分子细胞学和van Leeuwenhoek中心的助理教授,用于高级显微镜(阿姆斯特丹大学)。他开发,特征,使用遗传编码的荧光探针。你可以在推特上关注他:@joachimgoedhart.

Marieke Mastop爆头Marieke Mastop是在分子细胞学(阿姆斯特丹大学)的博士学位候选人,在那里她开发了基于遗传编码的基于FRET的生物传感器。

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