CRISPR / Cas9组件

由乔尔·麦克达德

2020年3月26日更新。

在最基本的层面上,CRISPR / Cas9基因组编辑系统使用非特异性内切酶(Cas9或密切相关Cpf1)来切割基因组和一个小RNA (gRNA)来引导这个核酸酶到一个用户定义的剪切位点。在阅读这篇文章后,我们希望你能掌握许多主要的CRISPR术语,并能够描述各种CRISPR/Cas9组件的功能。请注意,虽然这篇文章旨在提供CRISPR组件的总体概述,但新的Cas9变体一直在被发现,这些不同系统的需求可能会有所不同(例如,xCas9是一种具有更高PAM灵活性的变体eSpCas9/SpCas9-HF1具有更高的靶向特异性)。

Cas9核酸内切酶的功能

而天然CRISPR/Cas系统有各种负责处理外源DNA的酶,以及用于内切酶功能所需的RNA引导基因组工程,唯一需要的CRISPR蛋白是Cas9内切酶或其变体。这种蛋白质具有以下所需的所有成分:

1.结合到一个引导RNA

引导RNA将在下面详细描述,它使Cas9能够切割许多可能位点的特定基因组位点。Cas9在没有与引导RNA结合的情况下不能被切割。

2.如果目标位于原间隔子邻近基序(PAM)的上游(5'),则在引导RNA的作用下与目标DNA结合gRNA结构由RNA 5'端间隔区和3'端弯曲支架组成。gRNA与Cas9形成Cas9:gRNA复合物。

Cas9内切酶与目标基因组位点的结合是由引导RNA中包含的目标序列和一个3碱基对序列介导的邻近的母序或PAM。为了使dsDNA被Cas9切割,它必须包含一个PAM序列,位于引导RNA靶向位点的下游(3’)。在没有引导RNA或PAM序列的情况下,Cas9既不会结合靶标,也不会切断靶标。不同生物体的Cas9同源物或不同实验室开发的Cas9突变体(见下表)对PAM有不同的要求。这些不同的PAM需求使研究人员能够针对许多不同的基因组位点。

3.切割目标DNA导致双链断裂(DSB)

Cas9及其变体有两个内切酶结构域:n端ruvc样核酸酶结构域和靠近蛋白中心的hnh样核酸酶结构域。在目标结合后,Cas9经历构象变化,定位核酸酶结构域,切割目标DNA的相反链。因此,cas9介导的DNA损伤的最终结果是在PAM序列上游的靶DNA ~3-4个核苷酸内产生一个DSB。

Cas9物种/变种和PAM序列

物种/ Cas9变体

PAM序列

酿脓链球菌(SP);SpCas9

3 ' NGG

SpCas9 D1135E变体

3' NGG(减少NAG结合)

SpCas9 vr变体

3 ' NGCG

SpCas9 EQR变体

3 ' NGAG

SpCas9 VQR变体

3' NGAN或NGNG
xCas9 3' NG, GAA,或GAT
SpCas9-NG 3 ' NG
金黄色葡萄球菌(SA);SaCas9 3' NNGRR或NNGRR(N)
Acidaminococcus sp. (AsCpf1)和LbCpf1 (LbCpf1) 5 ' TTTV
AsCpf1 RR变体 5 ' TYCV
LbCpf1 RR变体 5 ' TYCV
AsCpf1 RVR变体 5 ' TATV
空肠弯曲杆菌(CJ) 3 ' NNNNRYAC
脑膜炎奈瑟氏菌(NM) 3 ' NNNNGATT

乳酸链球菌(ST)

3 ' NNAGAAW

密螺旋体属denticola(TD)

3 ' NAAAAC


合成引导RNA或gRNA(有时是sgRNA)

在天然的II型CRISPR/Cas系统中,Cas9在两种rna的帮助下被引导到其目标位点crRNA它定义了Cas9的基因组目标,以及tracrRNA它作为连接crRNA和Cas9的支架,促进来自CRISPR阵列的pre-crRNA的成熟crRNA的加工。在大多数用于crispr介导的基因组编辑系统中,这两个小RNA被浓缩成一个RNA序列,称为引导RNA (gRNA)或单引导RNA (sgRNA)。在这篇文章的其余部分,我们将把这种RNA复合物称为“gRNA”。gRNA既包含引导Cas9到特定基因组位点的20个核苷酸目标序列,也包含结合Cas9所需的支架序列。当使用CRISPR/Cas9进行基因组编辑时,研究人员只需要表达一个用于引导Cas9到他们所选择的目标序列的gRNA(见小贴士设计一个gRNA)和他们的首选Cas9变体(与适当的PAM序列),以修改所需的基因组位点。

在Addgene中找到含有gRNAs的质粒

一些历史记录

细菌基因组中的CRISPR阵列由由独特序列分离的重复元件组成。当研究人员第一次发现这些数组时,他们并不知道它们的功能,只是简单地把重复元素称为“直接重复”,把它们之间独特的DNA链称为“间隔区”(见下图)。

经过多年的研究,我们现在知道,每一个直接重复,结合其相邻的间隔,最终编码一个crRNA。直接重复区包含将前crRNA加工成成熟crRNA和tracrRNA结合所需的序列。另一方面,间隔区是特定于每个crRNA的独特的外来DNA目标序列。

总之,“直接重复区”与tracrRNA结合形成gRNA的支架部分,“间隔区”形成目标序列。

描述细菌CRISPR基因组阵列及其处理的图表

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