用新的基因组脆脆屏幕设计控制偏离目标效果

由Beth Kenkel.

Beth Kenkel.

基因组 -CRISPR / CAS9屏幕是一种用于识别生物过程中涉及的基因的高通量系统方法。这些屏幕为基因组宽的RNAi筛网提供了替代方案,尽管高效,受到低靶效果,非特异性毒性和偏离目标效果的影响。RNAi屏幕的缺陷具有很好的特征,并存在对这些故障控制的策略。但是,如果CRISPR屏幕存在类似的缺陷,并且如何最好地将这些屏幕设计用于控制缺陷的类似缺陷,还不清楚。最近Bassik Lab.在斯坦福制定了一个新的基因组 - 宽焦杠淘汰赛分析关于CRISPR屏幕设计的以下未解决问题。

关于基因组CRISPR / CAS9屏幕设计的未解决问题

  • 是非靶向指导的适当控制?许多CRISPR屏幕使用非目标指南作为负控。非目标导向器不会针对基因组中的任何网站。这意味着在控制GRNA和CAS9表达的许多效果的同时,它们未能考虑CAS9诱导的DSDNA断裂的影响。
  • 在基因组 - 范围内截止目标切割模式,类似于单程研究中看到的图案?减少CAS9偏离目标效果的许多策略但是,大多数研究都集中在只有少数指南的脱离目标切割。如果脱机削减困扰着高吞吐量Crisprpr屏幕的结果,则目前尚不清楚。
  • 简短指南(17-18 BP)比全长指南(19-20bp)有较少的偏离目标切割吗?小型研究(Tsai等福等人)建议17-19 BP长导向器减少了脱靶切割,而不会降低目标活动,但如果这在基因组范围内,则目前还不清楚。

概述Bassik库的图形。安全目标指导更好地控制DSDNA打破毒性。偏离目标切割不会混淆屏幕结果。短GRNA具有比全长GRNA更低的偏移截止点。

Bassik Lab的Crisprpruckout图书馆

图书馆概述

为了更好地定义CRISPR淘汰赛屏幕的最佳条件,BASSIK实验室创建了一个人类敲除库,每种基因具有10根GRNA,并靶向所有〜20,500种蛋白质编码基因。基因组中的独特,非重叠位点被靶向并预测目标活性与选择指南时预测的脱靶活动平衡。指南被交付为一个汇总图书馆通过A.慢动脉矢量对稳定表达Cas9或已被Cas9感染的慢病毒的细胞系。

验证图书馆

通过增长屏幕和A验证CISPRPLACKOUT图书馆丽锡毒性筛选,因为之前已经确定了两种途径的必要性和非必需基因(哈特等,Bassik等人)。该文库在两个屏幕中表现良好,具有1%错误发现率的生长筛选,并鉴定了先前鉴定的必要基因的> 88%,而先前的CAS9和ShRNA文库屏幕仅鉴定了60%的基因。蓖麻毒性筛选具有10%的假发现率,并确定了67%以前鉴定的蓖麻毒性基因。该筛查还发现了以前没有与蓖麻标准相关的几种基因,包括几乎所有参与蓖麻油吸收所需的细胞表面甘油的基因。蓖麻筛网确实未识别一些已知的蓖麻调节剂,但大多数这些基因对于生长也是必不可少的,并且预计不会在CRISPR淘汰赛中识别。

改善CRISPR淘汰赛屏幕的设计

在潜入结果之前,重要的是要注意在Morgens等人中,如果他们从屏幕上耗尽,导游被认为是有毒的。这种毒性被用来检测Cas9切割的代理。

安全的目标指导指导更好地控制非特异性毒性而不是非目标导向器

首先,Morgens等人。在屏幕分析和击中呼叫时,看看安全目标指南与非定位指南的影响。图书馆包括5,644个非目标指南和6,750个安全目标指南。安全靶向引导件被设计用于靶向没有注释功能的基因组位点,即缺乏开放染色质标记,DNase超敏反应或在增强子,转录因子结合位点或编码区域中的位点。瞄准这些网站应该控制指导表达和DSDNA断裂的影响。

非目标与安全目标指南

在生长筛选中,安全靶向引导率比其非靶向对应物更大的速率耗尽,这表明安全目标导向器比非靶向指南更具毒性。毒性可能是由于DNA损伤及其随后的修复。此外,用于安全靶向导向器的富集和耗尽分数的分布更紧密地反映基因靶向指南,这表明安全靶向导向器更好地控制由CRISPR引起的DSDNA断裂的固有效应或背景噪声。有关更多详细信息,请参阅补充图6。

安全目标导游也改变了来自生长和蓖麻筛网的命中。当使用安全瞄准指南从生长筛网调用命中时,P值不如使用非靶向引导件作为对照时的重要性。不太重要的p值导致更虚假的结果(即未能识别击中的基因);但它们也导致较少的假阳性结果(即,错误地称之为击中的基因,当真的不是)。实际上,这意味着当使用相同的假发现速率截止时,使用与使用时,使用安全目标指南将导致比使用非目标指南的真正阳性击球列表较小。

与使用非靶向导向器作为对照产生的结果相比,将安全靶向引导件添加到CRISPR库中,导致已知的蓖麻毒素调节基因的P值增加和降低。While it’s not clear how safe-targeting guides will affect phenotype in all non-growth screens, these results suggest that safe-targeting guides may serve as better controls than non-targeting guides and may more accurately determine the significance of hits in non-growth screens.

脱靶切割不会混淆CRISPR屏幕的结果

接下来,分析了与偏离目标网站的指南的毒性。具有精确或1-BP不匹配的指南与具有零不匹配的导向器具有更大的毒性。如果他们有5个偏离目标网站,则具有2-BP不匹配的指南仅毒性。来自筛选的结果还再现了几种以前观察到的特征,其影响GRNA偏离目标活动的特性:1)更接近PAM的不匹配比对PAM的更远侧的不匹配,2)具有高GC含量的引导件具有更大的偏离目标活动。

短GRNA具有较低的离目标切割和类似的靶向切割作为全长GRNA

最后,使用全长(19-20bp)或短(17-18bp)指南探索导指长度对非目标切割的影响。当比较具有1-BP不匹配场地的导向器的毒性时,与全长指南相比,短引导性降低了毒性。短导毒性的毒性降低可能是由于较低的靶向活动,但它也可能是由降低目标活性引起的。然而,用短期和长导轨鉴定的蓖麻毒素敏化酶的枯竭没有显着差异。这些结果表明,短导指向比长指南更少的离目标效果,并且没有重大降低目标疗效。

Morgens等人的结果。表明,基因组 - 范围的CRISPR屏幕容易出现与RNAi屏幕相同的一些相同的缺陷,例如由于缺点和偏离目标效应,但也提出了控制这些效果的策略。通过测试数千个用于偏移活动的指南,Morgens等人的概括结论有关偏离目标活动,证明了安全目标指南作为潜在的控制,并提供截短的GRNA改善特异性的证据,只有少量损失- 高吞吐量屏幕中的特性活动。这人类BASSIK CRISPR淘汰图书馆的版本可从ADDGENE获得!


参考

1。Morgens,David W.等人。“使用CAS9在高通量屏幕中使用CAS9毒性的离心活动的基因组测量。”自然通信8(2017):15178。PubMed.PMID:28474669.。pmed中央PMCID:PMC.5424143

2。Tsai,Shengdar Q.,等。“指南-SEQ通过CRISPR-CAS核酸酶使脱靶切割的基因组分析。”自然生物技术33.2(2015):187。PUBMEDPMID:25513782pmed中央PMCID:PMC4320685.

3.傅,yanfang等。“使用截短的导向RNA改善CRAP-CAS核酸酶特异性。”自然生物技术32.3(2014):279PMID:24463574。pmed中央PMCID:PMC3988262

4. HART,Traver等人。“测量基因组扰动屏幕的误差率:人类功能基因组学的黄金标准。”分子系统生物学10.7(2014):733. PUBMEDPMID:23394947。pmed中央PMCID:4299491

5. Bassik,Michael C.等人。“系统哺乳动物遗传相互作用图揭示了蓖麻植物的途径。”细胞152.4(2013):909-922。PubMed.PMID:23394947。pmed中央PMCID:3652613

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