Cpf1:一种新的CRISPR基因组编辑工具

由玛丽传动装置

玛丽传动

2020年8月13日更新。

注:Cpf1又称Cas12a。

Cpf1 Cas9酶。Cpf1是一类2类CRISPR-Cas系统的单一rna引导内切酶

2015年,Zetsche et al。加入到CRISPR工具箱中,有了它们的两个特征Cpf1在哺乳动物细胞中显示卵裂活性的同源物。与Cas9核酸酶一样,Cpf1家族成员也包含一个类似于ruvc的内切酶结构域,但缺乏Cas9的第二个HNH内切酶结构域。Cpf1以交错的方式切割DNA,只需要一个RNA,而不是Cas9切割所需的两个RNA (tracrRNA和crRNA)。在某些情况下,Cpf1可能比Cas9更适合基因组编辑-继续阅读了解更多关于Cpf1和查看我们的CRISPR指南用于进修Crispr / Cas9。

Cpf1是如何被发现和测试的?

2类CRISPR系统,包括基于II型CAS9的系统,需要单组分核酸酶来介导裂解而不是第1类系统所采用的多亚基复合物。推定的新级2核酸酶,CPF1(Crispr来自普氏菌弗朗西斯氏菌属),在若干基因组中注释,被归类为V型CRISPR系统。与CAS9一样,CPF1含有一种类似RUVC的内切​​核酸酶域,但它缺乏CAS9的其他HNH内核酸酶域,表明CPF1功能不同。由于CPF1基因座广泛分布在细菌物种上,Zetsche等人。假设CPF1可能代表功能性CRISPR核酸酶,其可以适用于基因组编辑。使用不同的核酸酶可能会克服Cas9的一些缺点 - 即它的钝双链切割和富含G的PAM要求。

Zetsche等人从零开始对Cpf1核酸酶进行表征。使用弗朗西斯氏菌属cpf1(FNCPF1),他们雇用了一个大肠杆菌质粒耗尽测定发现FNCPF1PAM序列要求。Cpf1偏好的PAM是5’-TTN,而Cas9(3’-NGG)在基因组位置和gc含量上都不同。经过测序并寻找对Cpf1功能重要的细胞rna后,他们发现Cpf1介导的裂解成熟crrna的长度为42-44个核苷酸,与Cas9的大小大致相同,但在间隔区之前而不是在间隔区之后直接重复。Cpf1 crRNA的结构也比Cas9简单得多;在直接重复区,只有一个短的茎环结构是裂解目标所必需的。Cpf1也不需要额外的tracrRNA。

一旦他们确定了CRISPR-Cpf1的最小元素,Zetsche等人就开始描述其裂解模式。他们又一次大吃一惊了!Cas9在PAM位点上游3 nt处产生钝端,而Cpf1则以交错的方式切割,在离PAM位点18-23个碱基处产生一个5核苷酸5 '。有了这些信息,他们转向细胞培养系统,看看是否有任何Cpf1核酸酶会表现出来在活的有机体内哺乳动物细胞的活动。来自16个不同的Cpf1候选人,Zetscheet al。发现两者,显示与Cas9类似的稳健切割活动。这两种核酸酶,AsCpf1LBCPF1(分别有1307和1228个氨基酸长),两者都以类似FnCpf1的交错模式切割。

CPF1在Cas9上的潜在优势

基于Cas9的II型CRISPR系统被认为是最简单的CRISPR系统,最容易适应基因组编辑,但V型cpf1驱动系统的引入为CRISPR工具箱增加了另一个选择。Cpf1的交错剪切模式开辟了定向基因转移的可能性,类似于传统的限制性内切酶克隆。粘端介导的基因转移对于非分裂细胞尤其有帮助,因为这些细胞很难被修饰homology-directed修复(HDR).Cpf1还可以将CRISPR瞄准的位点数量扩大到缺乏SpCas9青睐的3’-NGG PAM位点的AT-rich区域或AT-rich基因组。

由于CPF1不需要TRACRRNA,因此CRRNA引导率仅为〜42 nt。这些CRRNA的直接合成应比CAS9功能所需的〜100nt CRRNA / TRACRNA混合引导率明显便宜。由于CPF1及其指南RNA都小于SPCAS9对应物,因此它们也将更容易地提供低容量向量,例如adeno相关病毒(AAV)向量.2017年,Zetsche et al。开发了一个Cpf1多路复用的方法使用一个crRNA阵列表达多达4个crRNA。

Zetsche et al。还表明CPF1可以提高HDR的频率非同源endjoining(nhej).cas9介导的NHEJ通常会破坏PAM位点,因为它靠近裂解位点,从而阻止未来的编辑。相比之下,由于Cpf1的裂解距离PAM相对较远,NHEJ可能会保留PAM的位点。因此,如果Cpf1介导的切割后HDR最初没有发生,PAM的持续存在可能使Cpf1具有再次切割的能力,并可能介导HDR。这种“第二次机会”机制可能会提高理想的HDR编辑频率,但这种可能性尚未得到实验证实。为了防止hdr后的新编辑,修复模板应该删除PAM序列。

比较CPF1和CAS9以目标和脱靶效率

当第一次确定CPF1时,我们对其目标和非目标编辑效率不太了解。金等。Kleinstiver等.特征在于已知在哺乳动物细胞,LBCPF1和ASCPF1中有活性的两种CPF1矫正效率的基因组宽编辑效率。在两个报告中,CPF1 Orthologs的目标编辑效率仅略低于广泛使用的SPCAS9并与SACAS9相媲美。如Cas9 Orthologs所示,CPF1效率随GRNA序列而变化很大。

这两个组都使用多种方法来检查CPF1脱机目标编辑。首先,它们设计了在23碱基序列中具有单一的单一不匹配的GRNA。双重错配烧蚀CPF1活动,除非存在于目标序列的3'末端(Bases 19-23)中。CPF1对单一不匹配也敏感,但可变,因此,Kleinstiver等人。报告CPF1可以耐受GRNA位置1,8,9和19-23的不匹配。因此,GRNA靶序列的3'末端在CPF1介导的编辑中没有必要的功能,如Kleinstiver等人。在目标序列的3'末端,在4-6个基础缺失中看到CPF1活性的降低。

双和单碱基对GRNA-靶错配对ASCPF1或LBCPF1改性的影响。在引导件的PAM序列或靠近的PAM序列中的不匹配位置比其他不匹配更容易耐受。

Cpf1的优势可能在于其较低的脱靶编辑率,这是通过复杂的全基因组分析确定的。在其许多计算预测的脱靶位点上,Cpf1并不介导可检测的脱靶切割。大多数gRNAs在1-12个脱靶位点上定向低频Cpf1切割;相反,根据Kim等人的研究,SpCas9可能在约90个位点发生裂解。Kim等人还比较了AsCpf1和LbCpf1的总脱靶修饰与脱靶修饰的比值,发现两者的脱靶活性都低于之前观察到的SpCas9。kleinsver等人认为AsCpf1的脱靶率与高保真cas9相似ESPCAS9和SPCAS9-HF1.ascpf1和lbcpf1核糖核蛋白(RNPs)未能在细胞培养模型中诱导脱靶编辑。

Cpf1在基因组编辑中的应用在基础科学和翻译应用方面都是令人兴奋的。这种V型CRISPR系统的发现证明了我们对CRISPR生物学还有很多需要了解的。后来的工作,喜欢改编Cas13到RNA靶向RNA编辑,进一步显示了基于crispr的系统的多样性。


参考文献

1. Zetsche,Bernd等人。“CPF1是2类CRAP-CAS系统的单一RNA引导的内切核酸酶。”细胞(2015).PubMedPMID: 26422227

2. Zetsche,Bernd等人。“使用单个CRRNA阵列通过CRISPR-CPF1编辑的多重基因编辑。”NAT BIOTECHNOL。35.1(2016): 31-34。PubMedPMID: 27918548。

Kim,Daesik等人。基因组的分析显示人细胞中CPF1内切核酸酶的特异性。NAT BIOTECHNOL。(2016)。PubMedPMID: 27272384

kleinver, Benjamin P.等人。人类细胞中CRISPR-Cas Cpf1核酸酶的全基因组特异性NAT BIOTECHNOL。(2016)。PubMedPMID:27347757

Makarova, Kira S等。“CRISPR-Cas系统的最新进化分类。”NAT Rev Microbiol。(2015).PubMedPMID:26411297

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