Cpf1:一种新的CRISPR基因组编辑工具

由玛丽传动装置

2020年8月13日更新。

注:Cpf1又称Cas12a。

Cpf1 Cas9酶。Cpf1是一类2类CRISPR-Cas系统的单一rna引导内切酶

在2015年,Zetsche et al。加入到CRISPR工具箱中,有了它们的两个特征CPF1在哺乳动物细胞中显示卵裂活性的同源物。与Cas9核酸酶一样,Cpf1家族成员也包含一个类似于ruvc的内切酶结构域,但缺乏Cas9的第二个HNH内切酶结构域。Cpf1以交错的方式切割DNA,只需要一个RNA,而不是Cas9切割所需的两个RNA (tracrRNA和crRNA)。在某些情况下,Cpf1可能比Cas9更适合基因组编辑-继续阅读了解更多关于Cpf1和查看我们的CRISPR指南复习一下CRISPR/Cas9。

Cpf1是如何被发现和测试的?

第二类CRISPR系统,包括II型基于cas9的系统,需要一种单组分核酸酶来介导裂解,而不是第一类系统使用的多亚基复合物。一个假定的新的2类核酸酶,Cpf1 (CRISPR来自普氏菌弗朗西斯氏菌属),在多个基因组中进行了注释,被归类为V型CRISPR系统。与Cas9一样,Cpf1也包含一个类似于ruvc的内切酶结构域,但缺少Cas9的其他HNH内切酶结构域,说明Cpf1的功能不同。由于Cpf1基因座在细菌物种中广泛分布,Zetsche等人推测Cpf1可能代表一种可用于基因组编辑的功能性CRISPR核酸酶。使用一种不同的核酸酶可能会克服Cas9的一些缺点,即钝性双链切割和对g -丰富PAM的需求。

Zetsche等人从零开始对Cpf1核酸酶进行表征。使用弗朗西斯氏菌属Cpf1 (FnCpf1),他们雇用了一位大肠杆菌质粒耗尽法发现FnCpf1PAM序列要求。Cpf1偏好的PAM是5’-TTN,而Cas9(3’-NGG)在基因组位置和gc含量上都不同。经过测序并寻找对Cpf1功能重要的细胞rna后,他们发现Cpf1介导的裂解成熟crrna的长度为42-44个核苷酸,与Cas9的大小大致相同,但在间隔区之前而不是在间隔区之后直接重复。Cpf1 crRNA的结构也比Cas9简单得多;在直接重复区,只有一个短的茎环结构是裂解目标所必需的。Cpf1也不需要额外的tracrRNA。

一旦他们确定了CRISPR-Cpf1的最小元素,Zetsche等人就开始描述其裂解模式。他们又一次大吃一惊了!Cas9在PAM位点上游3 nt处产生钝端,而Cpf1则以交错的方式切割,在离PAM位点18-23个碱基处产生一个5核苷酸5 '。有了这些信息,他们转向细胞培养系统,看看是否有任何Cpf1核酸酶会表现出来在活的有机体内哺乳动物细胞的活动。来自16个不同的Cpf1候选人,Zetscheet al。发现有两种表现出与Cas9相似的强大的切割活性。这两种核酸酶,AsCpf1LbCpf1(分别有1307和1228个氨基酸长),两者都以类似FnCpf1的交错模式切割。

Cpf1相对于Cas9的潜在优势

基于Cas9的II型CRISPR系统被认为是最简单的CRISPR系统,最容易适应基因组编辑,但V型cpf1驱动系统的引入为CRISPR工具箱增加了另一个选择。Cpf1的交错剪切模式开辟了定向基因转移的可能性,类似于传统的限制性内切酶克隆。粘端介导的基因转移对于非分裂细胞尤其有帮助,因为这些细胞很难被修饰homology-directed修复(HDR)。Cpf1还可以将CRISPR瞄准的位点数量扩大到缺乏SpCas9青睐的3’-NGG PAM位点的AT-rich区域或AT-rich基因组。

由于Cpf1不需要一个tracrRNA, crRNA向导只有~42 nt长。这些crRNA的直接合成要比Cas9功能所需的~100 nt crRNA/tracrRNA杂交引导物便宜得多。由于Cpf1及其引导rna都比SpCas9小,它们也更容易在低容量载体中传递,例如腺相关病毒(AAV)载体。在2017年,Zetsche et al。开发了一个Cpf1多路复用的方法使用一个crRNA阵列表达多达4个crRNA。

Zetsche等人也认为Cpf1可以提高HDR的频率异源endjoining (NHEJ)。Cas9介导的NHEJ通常会因其对裂解部位的邻近而破坏PAM网站,防止未来的编辑。相比之下,由于CPF1相对较远地远离PAM,NHEJ可能会保留PAM网站。因此,如果在CPF1介导的切割后,HDR最初不会发生,则帕姆的持续存在可能给CPF1再次切割和可能介导HDR的能力。这种“第二次机会”机制可能会改善所需的HDR编辑的频率,但尚未经过实验证实的可能性。为防止新编辑后HDR,修复模板应删除PAM序列。

比较Cpf1和Cas9的靶上和靶外效率

当Cpf1首次被识别时,我们并不知道它的目标编辑效率和目标编辑效率。金等。Kleinstiver等。对LbCpf1和AsCpf1这两个已知在哺乳动物细胞中具有活性的Cpf1同源基因的全基因组编辑效率进行了分析。在这两份报告中,Cpf1同源基因的目标编辑效率仅略低于广泛使用的SpCas9,与SaCas9相当。从Cas9同源中可以看出,Cpf1的效率随gRNA序列的变化而变化很大。

两组都使用了多种方法来检查Cpf1脱靶编辑。首先,他们在整个23个碱基序列中设计了单和双错配的gRNAs。双错配减弱了Cpf1的活性,除非它们出现在目标序列的3’端(碱基19-23)。Cpf1对单次错配也很敏感,但kleinsver等报道Cpf1可以耐受gRNA位置1、8、9和19-23的错配。因此,gRNA靶标序列的3’端在Cpf1介导的编辑中并不具有必要的功能,因为kleinsver等人在靶标序列的3’端缺失了4-6个碱基,Cpf1的活性并没有下降。

双和单碱基对grna靶点错配对AsCpf1或LbCpf1修饰的影响在PAM序列或指南的3'端附近的不匹配位置比其他不匹配更容易被容忍。

CPF1的强度可能位于其低目标编辑率,使用复杂的基因组的分析确定。在其许多计算上预测的偏离目标站点中,CPF1不会调解可检测的脱靶切割。大多数GRNA指示在1-12个偏离目标站点的低频CPF1裂解;相比之下,根据Kim等人,SPCAS9可以在〜90个地点切割。金等。还将总脱靶与ASCPF1和LBCPF1的靶向修饰的比率进行了比较,发现两种直晶均显示出低于先前用SPCAS9观察到的脱靶活动。Kleinstiver等人。建议ASCPF1的偏移率类似于高保真CAS9eSpCas9和SpCas9-HF1。AsCpf1和LbCpf1核糖核蛋白(RNPs)未能在细胞培养模型中诱导脱靶编辑。

Cpf1在基因组编辑中的应用在基础科学和翻译应用方面都是令人兴奋的。这种V型CRISPR系统的发现证明了我们对CRISPR生物学还有很多需要了解的。后来的工作,喜欢改编Cas13到RNA靶向RNA编辑,进一步示出了基于CRISPR的系统的多样性。


参考

1.蔡澈,贝恩德等。“Cpf1是一类2类CRISPR-Cas系统的单一rna引导内切酶。”细胞(2015)。PubMedPMID: 26422227

2.蔡澈,贝恩德等。使用单一crRNA阵列的CRISPR-Cpf1多重基因编辑生物科技Nat》。35.1(2016): 31-34。PubMedPMID: 27918548。

3.Kim Daesik等。全基因组分析显示Cpf1内切酶在人类细胞中的特异性。生物科技Nat》。(2016)。PubMedPMID: 27272384

kleinver, Benjamin P.等人。人类细胞中CRISPR-Cas Cpf1核酸酶的全基因组特异性生物科技Nat》。(2016)。PubMedPMID: 27347757

Makarova, Kira S等。“CRISPR-Cas系统的最新进化分类。”Nat Microbiol牧师。(2015)。PubMedPMID: 26411297

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主题:CRISPR,中科院的蛋白质

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