crispr介导的植物碱基编辑器

客人的博客

这篇帖子由宾夕法尼亚州立大学的富布赖特访问学者Kutubuddin Molla贡献。

假设你在处理一个有缺陷的基因,Xm,它的序列和正确的基因Xw是一样的,除了一个碱基。如果你听说过CRISPR,你可能会想到一个问题:CRISPR能精确地修复有缺陷的基底吗?

直到2016年,精确的单碱基变化只有通过开发同源定向修复(HDR)途径它在细胞中以低频率发生,依赖于供体DNA的高效传递来促进修复。自从发展以来crispr介导的碱基编辑,这些类型的维修现在可以比以前更有效地进行。一个碱基编辑器精确地更改一个碱基,其效率通常在25-75%之间,而通过HDR精确更改的成功率限制在0-5%。这篇博文涵盖了不同的基本BE技术及其对植物基因组编辑的适应性的简要回顾。

胞嘧啶基础编辑器(CBE)

2016年,当两个独立的研究小组(Komor等人,2016Nishida等人,2016)通过将胞嘧啶脱氨酶与Cas9 nickase (nCas9)结合,发明了crispr碱基编辑器。nCas9仅通过切断单链就在DNA上制造了一个缺口,极大地降低了有害indel形成的可能性。与DNA结合后,CBE将目标胞嘧啶(C)脱氨成尿嘧啶(U)碱基。后,合成U-G一对是由细胞修复错配修复机械制造一对原来的c g转换为一或恢复到原来的c g基地切除修复由尿嘧啶糖基化酶(图1)。尿嘧啶糖基化酶抑制剂的存在(UGI)最小化第二个结果,增加的生成期望的T-A碱基对。

由胞嘧啶碱基编辑器与腺嘌呤碱基编辑器安装的过渡突变

腺嘌呤碱基编辑器

如果你有另一个基因Y,它有一个缺陷等位基因Ym,你需要将腺嘌呤(a)转化为鸟嘌呤(G),会怎样?您可能想知道CRISPR-base编辑器能否执行此更改。然而,没有自然已知的“DNA腺苷脱氨酶”理论上可以产生腺嘌呤碱基编辑器。

这是一个巨大的蛋白质工程Gaudelli et al。导致成功演变的腺苷脱氨酶,其可用于腺嘌呤基础编辑的DNA。他们首先创造了一种有缺陷的氯霉素抗性基因(凸轮R),通过引入点突变(H193Y)。通过腺嘌呤碱基编辑器逆转这种突变将恢复抗生素耐药性。为了找到这种蛋白质,他们创造了一个突变文库大肠杆菌TRNA腺苷脱胺酶(ECTADA),用DCAS9融合,并将其转化为大肠杆菌窝藏有缺陷的凸轮R基因。对幸存菌落的筛选以及随后几轮的进化和工程产生了一个突变体TadA (TadA*),该突变体令人满意地接受DNA作为其底物(见图2)。

人工进化的腺苷脱氨酶催化一个目标' a '到' I '(肌苷),它被细胞聚合酶视为' G '。随后,原基因组的a - t碱基对转化为G-C碱基对(图1)。由于细胞肌苷切除修复不如尿嘧啶切除活跃,ABE不需要CBE中任何额外的抑制蛋白,如UGI。

植物基因组的碱基编辑器

这些初步研究表明,在哺乳动物中碱基编辑是成功的,但在植物系统中缺乏碱基编辑器。因此,杨实验室在宾夕法尼亚州立大学(PSU)正在适应和改进植物系统的基础编辑平台。

工厂基本编辑

植物腺嘌呤碱基编辑器

我们开发了植物腺嘌呤碱基编辑器(ABE)载体,用于在植物基因组中安装A >g或T>C突变体。我们构建了三种版本的矢量(PKABE6.3,PKABE7.9和PKABE7.10),使得用户可以基于相对于PROTOSPACER相邻主题(PAM)的“A”的位置优化基础编辑效率。ABE7.10可以编辑目标'A'如果它位于一个小型基因组窗口:在原始筛选位置4-8时计数'ngg'pam为21-23(图3)。如果目标'A'更接近PAM,即,位于Protospacer,Abe6.3或Abe7.9中的8-10处定位,更适合(高德利等人,2017年)。我们的向量有两个Bsa1个位点克隆pol-III (OsU3)启动子驱动的表达系统中的单引导RNA(原间隔子+支架)。我们使用一个多顺反子tRNA-gRNA (PTG)基因系统克隆多个原始空间,使我们能够同时瞄准多个基因组遗址。

这些二元载体可用于生成稳定的基因组编辑植物农杆菌属介导的转换。我们也构建了更小的载体适合瞬态分析使用原生质体转化。

植物胞嘧啶碱基编辑器

有几种cbe可用于植物系统。基于目标援助(CBE-2)- 和基于rAPOBEC (CBE-1)- cbe是水稻、番茄、小麦和马铃薯的成功碱基编辑器。已知,基于靶标- aid和rAPOBEC的cbe可以分别将胞嘧啶脱氨基于原间隔子的2-6 bp和4-8 bp处。

如果目标胞嘧啶离PAM位点更近呢?利用hAPOBEC3脱氨酶开发的CBE可以在相对于PAM序列1-17 bp的拉伸窗口中编辑(宗等人。,2018年)(参见图3中的CBE-3)。

活动窗口植物基础编辑器

工厂CBE和ABE与膨化聚丙烯酰胺兼容性

上面提到的所有碱基编辑器都是基于SpCas9 nickase的,并依赖于与碱基(C/ a)适当距离的“NGG”PAM的存在来进行编辑。但是,这是否意味着远离“NGG”PAM的目标C或a是不可编辑的?它们可以,但它们需要其他基本编辑器平台。华等。构建了许多植物碱基编辑器,用SpCas9和SaCas9的突变版本替换SpCas9,这些突变版本识别PAM序列而不是NGG(表1)。

类型 Nickase Cas9 (D10A) 脱氨酶 PAM需求 参考
CBE. SpCas9 rAPOBEC1 n 6
SpCas9 目标援助(PMCDA1) n 5
SpCas9-VQR rAPOBEC1 NGA. 8
SACAS9-KKH. rAPOBEC1 NNNRRT 8
安倍 SpCas9 TADA-TADA * n 9 - 12
SpCas9-VQR TADA-TADA * NGA. 8
SACAS9. TADA-TADA * nngrrt. 9
SACAS9-KKH. TADA-TADA * NNNRRT 8
SpCas9-VRER TADA-TADA * NGCG. 8


设计基础编辑实验的提示

  1. 选择一个碱基编辑平台取决于你的目标碱基在原空间序列的位置。
  2. 如果你在你的目标基因组位点/位点没有找到一个合适的“NGG”PAM,根据PAM序列从表1中选择一个碱基编辑器变体。
  3. 避免在“G”基础之后立即放置'C',因为CBE在“GC”序列上下文中效率低。如果无法避免这种情况,请选择目标援助版本。
  4. 一些基因组位点的碱基编辑效率很低,甚至为零。由于核小体或其他蛋白质的存在,一些位点可能是碱基编辑器无法访问的。
  5. 你可以在转化/转染后的48-72小时内检测到碱基编辑。为了稳定转化,再生植株可以进行基因分型。如果成功的碱基编辑导致任何限制性内切酶(RE)识别位点的产生或破坏,重新分析PCR扩增产物的检测结果均可用于检测成功。尽管使用base编辑器生成indel的机会很小,但请记住,indel的生成有时也会导致RE站点的销毁。

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非常感谢我们的客座博主来自宾夕法尼亚州立大学的Kutubuddin Molla

Kutubuddin大Kutubuddin Molla是印度奥里萨邦切塔克国家水稻研究所的一名农业生物技术专家。目前库图布丁是美国宾夕法尼亚州立大学的富布赖特访问学者。Molla博士对水稻的精确基因组编辑感兴趣,并在PSU的杨义农实验室使用碱基编辑器和HDR方法改进水稻作物。

参考

1.Komor, Alexis C,等。"基因组DNA中目标碱基的可编程编辑不需要双链DNA裂解"自然533.7603(2016):420。PUBMEDPMID:27096365。公共医学中心PMCID:PMC4873371

2.Nishida,Keiji,等。“使用杂交原核和脊椎动物适应性免疫系统进行靶向核苷酸编辑。”科学353.6305 (2016): aaf8729。PubMedPMID:27492474

3.Gaudelli, Nicole M.等。"基因组DNA中A·T到G·C的可编程碱基编辑不需要DNA裂解"自然551.7681(2017):464PMID:29160308。公共医学中心PMCID:PMC5726555

4.谢,卡宾,巴斯蒂安·明肯伯格,杨一农。“通过内源性trna处理系统提高CRISPR/Cas9的多路编辑能力。”美国国家科学院院刊112.11(2015): 3570 - 3575。PubMedPMID:25733849。公共医学中心PMCID:PMC4371917

5.Shimatani,Zenpei等。“使用CRISPR-CAS9脱胺酶融合,”靶向稻米和番茄中的基础编辑。“自然生物技术35.5(2017): 441。PubMedPMID:28346401

6.宗、袁等。利用cas9 -胞苷脱氨酶融合对水稻、小麦和玉米进行精确的碱基编辑。自然生物技术35.5(2017): 438。PubMedPMID:28244994.

7.宗、袁等。“利用nCas9和人类APOBEC3A的融合,在植物中进行高效的C-to-T碱基编辑。”自然生物技术(2018)。PubMedPMID:30272679.

8.华,凯,小平陶,朱k朱。“通过使用CAS9变体扩展稻米中的基础编辑范围。”植物生物技术》杂志(2018)。PubMedPMID:30051586.

9.华、凯等。“水稻基因组从A·T到G·C的精确碱基编辑。”分子植物11.4(2018): 627 - 630。PubMedPMID:29476916

10。Kang, Beum-Chang等。“通过植物腺嘌呤碱基编辑进行精确基因组工程。”自然植物(2018): 1。PubMedPMID:29867128

11.李超等。在水稻和小麦中使用cas9 -腺苷脱氨酶融合扩展碱基编辑。基因组生物学19.1(2018): 59。PubMedPMID:29807545。公共医学中心PMCID:PMC5972399

12.杨永平,张建平,杨永平。水稻转录组基因的克隆与表达。《基因组工程:CRISPR-Cas革命》,冷泉港实验室(2018)。

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主题:CRISPR,植物生物学,基本编辑

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