CRISPR 101:表观遗传学和编辑外膜内组

由玛丽传动装置

玛丽传动

最初发表2017年2月14日,并更新了2020年6月24日。

表观遗传修饰是超越基因组序列的基因表达的另一层。表观蛋白酶的失调(基因组中的表观遗传修饰的总和)涉及疾病状态,并且靶向外形组织可能产生某些过程,如蜂窝重新编程IPSCS., 更高效。通常,表观遗传染色质修饰与基因表达的改变相关,但因果关系和机制仍然不明朗。如今,使用CRISPR的特定基因组基因座的靶向表观遗传修饰,并且Addgene具有许多工具以此目的。

表观遗传学开始作为一种相关领域,其中对DNA或组蛋白的共价修饰有助于包装DNA的蛋白质与基因表达或沉默有关。为了改变DNA修饰,研究人员使用钝的工具,如组蛋白脱乙酰酶,但是靶向表观遗传修饰是不可能的。随着基因组工程革命来了表观群体工程工具- 锌指核酸酶和粘贴融合到表观遗传调节剂,使用户指定的基因座在用户指定的基因座中进行了表观遗传修饰。

研究人员表明了这一点tale-tet1构造,它融合了TET1去甲基酶催化结构域,可以介导去甲基化并在各种启动子的CPG区域诱导转录。其他研究人员另外融合A.对LSD1组蛋白去甲基酶的效应器去去甲基化增强剂区(Mendenhall等,2013)。通过比较基因活化当增强剂活性或沉默时,它们可以鉴定先前无表升增强剂的靶基因。受欢迎的Talen为基础Lite System.使用光调节转录的光,还包括测量的组蛋白甲基转移酶和脱乙酰酶。

CRISPR和表观遗传学

与许多基于Talen的技术一样,CRISPR的出现使得旨在更容易!在...的帮助下指导RNA.,CAS蛋白和表观遗传改性剂之间的融合可以靶向特定的DNA序列。非编辑CRISPR应用直接催化死亡DCAS9与特定基因座融合到各种外延遗传调节剂,而不诱导双链断裂。下面您可以找到addgene提供的一些基于CRISPR的表观遗传调节剂。对于大多数这些构建体,催化死改性剂也可作为对照提供。对于CRISPR ePigeNetic工具的最新列表,请查看我们的CRISPR表观遗传资源资源

转录激活

p300乙酰转移酶

DCAS9融合到P300乙酰转移酶的催化结构域,增加了特定基因座的H3K27AC组蛋白改性的水平。Charles Gersbach的实验室已经存入哺乳动物表达结构,包括PCDNA-DCAS9-P300核心PCDNA3.3-NM-DCAS9-P300核心, 也PLV-DCAS9-P300-P2A-MATOR对于慢病毒表达。

CRISPR乙酰化

TET1去甲基酶

荣桂虎的实验室已创建PDCAS9-TET1-CD对于哺乳动物细胞的靶向胞嘧啶去甲基化。这种质粒配合使用PCDNA3.1-MS2-TET1-CD减少甲基化并激活转录。慢病毒载体与相同的修饰符,FUW-DCAS9-TET1CD,可从Rudolf Jaenisch的质粒形式的实验室或即用的慢病毒

CRISPR去甲基化

TET1启动DNA的胞嘧啶去甲基化。然而,DNA氧化和修复途径中的几种蛋白质在TET1下游工作,以恢复细胞苷除去后的DNA。最近,Albert Cheng的实验室发达了Casilio-Me,这是基于他们的Casilio系统。该系统允许单独递送TET1,或者与DNA氧化和修复因子相结合与其他TET1递送系统相比,目标位点的基因激活增加

转录镇压

DNA甲基转移酶3α(DNMT3A)

VlatkaZoldoš'实验室已存入PDCAS9-DNMT3A-EGFPpdcas9-dnmt3a-mator对于哺乳动物细胞中的靶向胞嘧啶甲基化。共表达标记EGFP和媒体使转导细胞的分选和选择。Grant Challen的实验室也创建了本文(PCMV-DCAS9-D3A)和Tet依赖(Teto-DCAS9-D3A) 结构体。对于慢病毒表达,FUW-DCAS9-DNMT3AFUW-DCAS9-DNMT3A-P2A-TAGBFP可从Rudolf Jaenisch的实验室获得,前者也可以提供即用的慢病毒

Crispr甲基化

DNA甲基转移酶MQ1

Margaret Goodell的实验室已经存入PCDNA3.1-DCAS9-MQ1(Q147L)-EGFP,DCAS9与原核生物的小DNA甲基转移酶融合mollicutes spiroplasma.M. SSS1.(称为MQ1。)Q147L突变改善甲基化动力学,使得胞嘧啶甲基化发生在24小时内而不是在几天内发生,如其他外膜膜胚胎编辑工具所见。PLV HUBC-DCAS9-MQ1(Q147L)-EGFP也可用于慢病毒转导。

赖氨酸特异性去甲基酶1(LSD1)

Tatjana Sauka-Spengler的实验室已经存入PX330A DCAS9-LSD1用于靶向除去H3K4ME1 / 2和H3K9ME2组蛋白修饰。与上面描述的Tale-LSD1系统一样,DCAS9-LSD1灭活靶向增强剂。虽然实验室在Chick Embryos中使用了该载体,但它也在哺乳动物表达系统中起作用。
Christopher Newgard的实验室融合了LSD1至较小的核酸酶死葡萄球菌Cas9(SA-CAS)和沉积的质粒IF311:PMagic(R4-R3)NLS-SA DCAS9-NLS-LSD1。LSD1是特别大的蛋白质,这种融合允许包装成病毒载体并靶向递送到硬于操纵细胞类型中。伟德BV下载他们也有熔融LSD1至X-Cas9(3.7)。X-Cas9(3.7)是SPCAS9突变体,其表现出增加的PAM柔韧性,并且该融合蛋白允许LSD1靶向更广泛的基因组靶标。这两个载体是较大的一部分PMVP / PMagic克隆系统,其中包含几种表观遗传改性剂的Cas9融合,并且是作为套件可用来自addgene。

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为什么使用表观遗传调节剂?

表观遗传修改肯定不是唯一基于CRISPR的技术,旨在改变基因表达。将DCAS9融为转录激活因子,如VP64或VPR激活转录,而DCAS9-KRAB融合转录。这两种方法还招募了表观遗传机械 - 但是使用直接表观遗传改性剂是有利的吗?

与任何实验一样,您所需的结果将确定您应该使用的工具。如果您想研究一个特定修改的特定修改,例如H3K27AC,可以获得Epigenetic工具将是您最好的选择。

Crisprp ePigeNetic工具的另一个潜在优势是他们的持久性和遗产。一旦效应器从系统中灭活/移除,就被认为是可逆的CRISPR激活剂和阻遏物。相反,靶向表观遗传改性剂留下的表观遗传标记可能更频繁地由子细胞继承。例如,Krab诱导的沉默是短暂的,迅速逆转文化。然而,在整个100天的实验期内,DNMT3A诱导的甲基化持续存在,因为这个标志忠实于文化和文化和体内

在某些情况下,表观遗传调节剂可以比活化剂/阻遏物更好 -DCAS9-P300比DCAS9-VP64增加了转录激活,特别是在靶向远端增强剂时。由于这些工具的效果很可能是细胞类型和上下文相关的,因此在设置实验系统时尝试多个CISPR工具可能有意义。在评论中,让我们了解您在这些构建体验中了解您的经验!

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Leah Schwiesow有助于更新本文。

参考

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  • 从加入该出版物中发现质粒。

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