CRISPR 101:同源性定向修复

由Chari Cortez.

最初发表2015年3月12日和最后更新的7月27,2020。

DNA病变是DNA的结构或碱基损伤的位点。也许是最有害的病变类型导致DNA链的破裂- - - - - -双股休息(DSB)- - - - - -由于DSB的修复对于基因组稳定性至关重要。DSB可以是由细胞内因素(如核酸酶和反应性氧)或电离辐射和紫外光等外力引起的;然而,这些类型的断裂随机而不可预测。为了提供一些对DNA断裂的位置的控制,科学家们具有工程化的基于质粒的体系,可以在特定位点靶向和切割DNA。无论是什么导致DSB,修复机制以相同的方式函数。

在这篇文章中,我们将描述同源定向修复的一般机制,重点是修复实验室中为基因组修饰目的而设计的断裂。

HDR修复模板在基因组DNA同源序列的中间包含一个特定的变化。在cas9诱导的DSB后,HDR将这种特定的变化引入基因组DNA,从而修复断裂。

同源性如何定向修复修复DNA双链断裂?

基因组稳定性需要正确和有效的DSB修复。在真核细胞中,DSB的机械修复主要由两个途径发生:异源End-Joining (NHEJ)和同源性定向修复(HDR)。NHEJ是典型的同源性无关的途径,因为它涉及只有一个到几个互补碱的对准,最多用于重新连接两端,而HDR使用更长的序列同源性来修复DNA病变。

这篇文章侧重于HDR,这是DSB修复的更准确机制,因为在DNA的受损和完整的供体股之间的损坏和完整供体股之间的序列同源性更高。如果用于修复的DNA模板与DSB的原始DNA序列相同,则该过程是无差错的,或者它可以介绍特定的突变进入受损的DNA。

有四种不同的HDR途径来修复dsb。以下是HDR途径的三个核心步骤:

  1. 5 '端的DNA链在断裂处被切除,形成3 '的突出部分。这将作为一个底物的蛋白质需要链入侵和DNA修复合成的引物。

  2. 然后,侵入股可以置换同源DNA双链的一股股线和另一股;这导致形成称为位移环(D循环)的杂种DNA的形成。这是HDR的定义点。

  3. 然后可以解决重组中间体以完成DNA修复过程

同源性定向修复途径

HDR可以是非保守或保守的。非保守方法由单链退火(SSA)途径组成,易于误差。保守方法,characterized by the accurate repair of the DSB by means of a homologous donor (e.g., sister chromatid, plasmid, etc), are composed of three pathways: the classical double-strand break repair (DSBR), synthesis-dependent strand-annealing (SDSA), and break-induced repair (BIR).

古典双链休息修复(DSBR)

在经典的DSBR通路中,3 '末端侵入完整的同源模板作为DNA修复合成的引物,最终导致双Holliday连接(dHJs)的形成。dhj是四链的分支结构,当入侵链的延伸“捕获”并从DSB的第二端合成DNA时形成。通过两种方法中的一种解理来分解单个HJs。看看下图的左分支,每个结点的分辨率都可能发生在交叉链上(紫色箭头处的水平方向)或非交叉链上(橙色箭头处的垂直方向)。如果不同地解析(例如,一个结在交叉链上解析,另一个结在非交叉链上解析),将发生交叉事件;然而,如果两个hj以相同的方式被解析,这将导致一个非交叉事件。DSBR是半保守的,因为交叉事件是最常见的。这个动画很好地说明了DSBR路径。

HDR示意图显示了双链断裂,链切除,链中的形成,链形成和DNA Snthesis。这可以使用双链断裂修复或合成依赖性股线退火来解决。

Synthesis-dependent strand-annealing(SDSA)通路

如上图的右侧分支所示,SDSA是保守的,并且仅在非交换事件中产生。这意味着所有新合成的序列存在于同一分子上。与DSBR不同,在SDSA中的链侵入和D环形成之后,侵入股的新合成部分从模板移位并返回到其他DSB末端的非入侵链的加工结束。非侵入性股线的3'末端伸长并连接以填充间隙,从而完成SDSA。

断裂诱导的修理途径

断裂诱导的修复(BIR)途径

BIR的特征不如DSBR或SDSA,但该通路的一个中心特征是DSB只有一个可用于修复的侵袭性末端。这个单一的入侵链入侵一个同源序列,同时启动前导链和后伴随链的合成,从而形成一个HJ。这个HJ通过交叉链的裂解来分解。虽然这一途径可能不能立即应用于dsb诱导的基因靶向或与质粒为基础的基因组工程相关,但它可能对染色体末端的修复具有生物学意义,因为染色体末端没有使DSBR或SDSA成为可能的第二端。

同源性指导修复和基因组工程

诱导DSB的基于质粒的方法采用了基因组工程的同源重组。锌手指核酸酶(ZFN),TAL效应核酸酶(TALENS)M和CRISPR都可以引导核酸酶引起特定的DSB。易于创造指南,系统的速度及其靶向多功能性不仅仅是重新改变基因组工程,而是真的彻底改变了该领域。

设计修复模板以创建突变的一般考虑

用于创建特定突变的HDR模板或将新元素插入基因需要一定量的同源围绕将被修改的目标序列。科学家最成功地使用了在Crispr-诱导的DSB中开始的同源臂。通常,修改的插入位点应非常接近DSB,如果可能,理想地小于10bp。查看我们的博客帖子提高HDR效率有关“切义距离”如何影响编辑效率的详细信息。

值得注意的是,一旦引入和修复DSB,CRISP酶可能继续裂开DNA。只要GRNA靶位点/ PAM网站保持完整,CAS9内切核酸酶将继续切割和修复DNA。如果您尝试介绍非常特定的突变或序列,则此重复编辑是有问题的。为了解决这个问题,您应该以这样的方式设计HDR模板,这些方式最终将在修复初始DSB之后最终阻止进一步的CAS9目标。阻断进一步编辑的两种常见方法是突变PAM序列或GRNA种子序列。

是什么让最好的修复模板:质粒DNA或单链供体寡核苷酸(SSODN)?

在设计维修模板时,您预期编辑的大小是一个重要因素。SSDNA模板(称为SSODNS)通常用于较小的修改。小插入/编辑可能需要为每个同源臂短达30-50个基地,但请记住这些数字可能根据您的兴趣点和实验系统而异。通常使用50-80个基础同源臂。不对称同源武器(36个基于PAM和91个底座的碱基底部底座)支持高达60%的HDR效率(玉米等,2016)。

由于与200个基础的长度创建SSODN相关的困难,研究人员使用了DSDNA质粒模板,用于较大的插入,例如荧光蛋白或选择盒。伟德2021足球欧洲杯买球平台这些模板应该具有至少800 bp的同源臂。具有质粒模板的HDR效率通常很低;为了增加编辑的频率,研究人员设计了设计的自切割质粒,其含有侧翼模板的GRNA靶位点。当CAS酶和适当的GRNA存在时,将模板从载体中释放出来。为了避免质粒克隆,科学家还使用PCR产生的长DSDNA模板,但这些模板可能对细胞有毒,从而降低编辑效率。DSDNA模板的另一个缺点是它们能够直接集成到基因组中,复制同源臂序列。

Easi-Crisp.,该技术允许研究人员进行大规模突变,以利用ssodn的好处(Quadros等人,2017)。要制造长度超过200个碱基的ssodn,你需要在体外转录编码你的修复模板的RNA,然后使用逆转录酶来制造互补的ssDNA。easy - crispr在小鼠敲入模型中工作良好,将dsDNA的编辑效率从1-10%提高到ssODNs的25-50%。尽管HDR效率因位点和实验系统而异,但ssODN模板通常提供最高频率的HDR编辑。查看我们的博客帖子Easi-Crisp.更多细节。

提升HDR优于NHEJ

为了在更常见的NHEJ修复机制中促进HDR,已经使用了抑制NHEJ和激活HDR等策略。Rees等。nambiar等。使用了RAD变体等HDR因素,如Rad18(Nambiar等,2019年)和HRAD51.(Rees等,2019)激活HDR。抑制剂如Cyren.可用于禁止NHEJ(Arnoult等,2017),而aCas9与显性阴性53BP1融合均抑制NHEJ并激活HDR(Jayavaradhan等,2019)。

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有用的连结及参考资料:

想知道更多?查看下面的其他资源,了解有关HDR和CRISPR的更多深入信息。我们的1946伟德 伟德官网 旨在帮助解释基本原则驾驶CRISPRs和基因组编辑技术。

链接:

一般同源重组参考:

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  • EASI-CRISPR:使用LONG SSDNA供体和CRISPR核糖核蛋白携带条件和插入等位基因的小鼠一步生成的鲁棒方法。Quadros RM等人。基因组医学杂志。18(1);(2017)。PubMed

注:Christina Mork对本文的更新做出了贡献。玛西·帕特里克和玛丽·吉尔林对本文的撰写有贡献。
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