CRISPR 101:同源定向修复

在沙里河科特斯

出版2015年3月12日,最后更新2020年7月27日。

DNA损伤是DNA结构或碱基对损伤的部位。也许最有害的损伤类型来自于两条DNA链的断裂- - - - - -双链断裂(DSB)- - - - - -因为DSBs的修复对基因组的稳定性至关重要。DSBs可以由核酸酶和活性氧等胞内因素,或电离辐射和紫外线等外力引起;然而,这些类型的断裂是随机和不可预测的。为了在一定程度上控制DNA断裂的位置,科学家们设计了基于质粒的系统,可以在特定的位点靶向并切割DNA。无论什么原因导致DSB,修复机制的功能都是相同的。

在这篇文章中,我们将描述同源定向修复的一般机制,重点是修复实验室中为基因组修饰目的而设计的断裂。

HDR修复模板在基因组DNA同源序列的中间包含一个特定的变化。在cas9诱导的DSB后,HDR将这种特定的变化引入基因组DNA,从而修复断裂。

同源定向修复是如何修复DNA双链断裂的?

基因组稳定性要求对DSBs进行正确、高效的修复。在真核细胞中,dsb的机制修复主要通过两条途径进行:异源End-Joining (NHEJ)和同源定向修复(HDR)。NHEJ是典型的同源无关途径,因为它最多只涉及一个到几个互补碱基的两端连接,而HDR使用更长的序列同源性来修复DNA损伤。

这篇文章的重点是HDR,这是一种更精确的DSB修复机制,因为损坏的DNA供体链和完整的DNA供体链之间需要更高的序列同源性。如果用于修复的DNA模板与DSB的原始DNA序列相同,或者它可以引入特定的突变进入受损的DNA。

有四种不同的HDR途径来修复dsb。以下是HDR途径的三个核心步骤:

  1. 5 '端的DNA链在断裂处被切除,形成3 '的突出部分。这将作为一个底物的蛋白质需要链入侵和DNA修复合成的引物。

  2. 入侵链可以取代同源DNA双链中的一条,并与另一条配对;这导致了被称为置换环(D环)的杂交DNA的形成。这是HDR的定义点。

  3. 重组中间体可以被分解完成DNA修复过程

同源性指导修复途径

HDR可以是非保守性发生,也可以保守性发生。非保守方法由单链退火(SSA)路径组成,更容易出错。的保守的方法以同源供体(如姊妹染色单体、质粒等)对DSB进行准确修复为特征,由三种途径组成:经典双链断裂修复(DSBR)、合成依赖链-退火(SDSA)和断裂诱导修复(BIR)。

古典双链休息修复(DSBR)

在经典的DSBR通路中,3 '末端侵入完整的同源模板作为DNA修复合成的引物,最终导致双Holliday连接(dHJs)的形成。dhj是四链的分支结构,当入侵链的延伸“捕获”并从DSB的第二端合成DNA时形成。通过两种方法中的一种解理来分解单个HJs。看看下图的左分支,每个结点的分辨率都可能发生在交叉链上(紫色箭头处的水平方向)或非交叉链上(橙色箭头处的垂直方向)。如果不同地解析(例如,一个结在交叉链上解析,另一个结在非交叉链上解析),将发生交叉事件;然而,如果两个hj以相同的方式被解析,这将导致一个非交叉事件。DSBR是半保守的,因为交叉事件是最常见的。这个动画很好地说明了DSBR途径。

HDR原理图显示了双链断裂形成、链切除形成、链内翻形成、D-loop形成和DNA snthesis。这可以用双链断裂修复或合成依赖链退火来解决。

Synthesis-dependent strand-annealing(SDSA)通路

如上图右支所示,SDSA是保守的,只导致非交叉事件。这意味着所有新合成的序列都出现在同一个分子上。与DSBR不同的是,在SDSA中,随着链入侵和D环的形成,入侵链的新合成部分从模板中被取代,并在DSB的另一端回到非入侵链的加工端。非侵入性链的3 '端被拉长并连接以填补空白,从而完成SDSA。

断路感应修复途径

断裂诱导修复(BIR)通路

BIR的特征不如DSBR或SDSA,但该通路的一个中心特征是DSB只有一个可用于修复的侵袭性末端。这个单一的入侵链入侵一个同源序列,同时启动前导链和后伴随链的合成,从而形成一个HJ。这个HJ通过交叉链的裂解来分解。虽然这一途径可能不能立即应用于dsb诱导的基因靶向或与质粒为基础的基因组工程相关,但它可能对染色体末端的修复具有生物学意义,因为染色体末端没有使DSBR或SDSA成为可能的第二端。

同源性指导修复和基因组工程

诱导DSB的基于质粒的方法采用了基因组工程的同源重组。锌手指核酸酶(ZFN),TAL效应核酸酶(TALENS)M和CRISPR都可以引导核酸酶引起特定的DSB。易于创造指南,系统的速度及其靶向多功能性不仅仅是重新改变基因组工程,而是真的彻底改变了该领域。

设计修复模板以创建突变的一般考虑

HDR模板用于创建特定的突变或插入新元素到一个基因需要一定数量的同源性周围的目标序列将被修改。科学家们最成功地使用了始于crispr诱导的DSB的同源臂。一般来说,该修饰的插入位置应该非常接近DSB,如果可能,最好小于10bp。查看我们的博客帖子提高HDR效率有关“剪切到突变距离”如何影响编辑效率的详细信息。

需要注意的重要一点是,一旦引入并修复DSB, CRISPR酶可能会继续切割DNA。只要gRNA靶位点/PAM位点保持完整,Cas9内切酶就会继续切割和修复DNA。如果你试图引入一个非常特定的突变或序列,这种重复的编辑是有问题的。为了解决这个问题,您应该以这样一种方式设计HDR模板,即在修复初始DSB后,最终阻止进一步的Cas9目标。阻止进一步编辑的两种常见方法是突变PAM序列或gRNA种子序列。

质粒DNA或单链供体寡核苷酸(ssodn)是最佳的修复模板?

在设计修复模板时,预期编辑的大小是一个重要因素。ssDNA模板(简称ssodn)通常用于较小的修饰。小的插入/编辑可能需要30-50个碱基为每个同源臂,但请记住,这些数字可能会根据你的兴趣所在和实验系统而变化。常用50-80碱基同源臂。不对称的同源性武器(PAM远端36个碱基和PAM近端91个碱基)支持HDR效率高达60% (Corn et al., 2016)。

由于创建长度超过200个碱基的ssodn存在困难,研究人员使用dsDNA质粒模板进行更大的插入,如荧光蛋白或选择盒。伟德2021足球欧洲杯买球平台这些模板应具有至少800 bp的同源臂。质粒模板的HDR效率普遍较低;为了增加编辑频率,研究人员设计了包含gRNA靶位点的自切割质粒。当Cas酶和适当的gRNA(s)存在时,模板从载体中解放出来。为了避免质粒克隆,科学家也使用pcr生成的长dsDNA模板,但这些模板可能对细胞有毒,从而降低编辑效率。dsDNA模板的另一个缺点是它们能够直接整合到基因组中,复制同源臂序列。

Easi-CRISPR,该技术允许研究人员进行大规模突变,以利用ssodn的好处(Quadros等人,2017)。要制造长度超过200个碱基的ssodn,你需要在体外转录编码你的修复模板的RNA,然后使用逆转录酶来制造互补的ssDNA。easy - crispr在小鼠敲入模型中工作良好,将dsDNA的编辑效率从1-10%提高到ssODNs的25-50%。尽管HDR效率因位点和实验系统而异,但ssODN模板通常提供最高频率的HDR编辑。查看我们的博客帖子Easi-CRISPR为更多的细节。

提升HDR优于NHEJ

为了在更常见的NHEJ修复机制中促进HDR,已经使用了抑制NHEJ和激活HDR等策略。里斯等。Nambiar et al。使用了RAD变体等HDR因素,如Rad18(Nambiar等,2019)和hRad51(Rees等人,2019年)来激活HDR。抑制剂等CYREN可用于抑制NHEJ (Arnoult等,2017),而aCas9与显性阴性53BP1融合两者都抑制NHEJ并激活HDR (Jayavaradhan等,2019)。

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有用的连结及参考资料:

想知道更多吗?查看下面的其他资源以获得关于HDR和CRISPR的更深入信息。我们的1946伟德 伟德官网 是为了帮助解释基本原则驾驶CRISPRs还有基因组编辑技术。

链接:

一般同源重组

  • 同源重组修复链断裂。Jasin M和Rothstein R。冷泉Harb展望生物(2013)。PubMed
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  • DNA双链断裂修复途径选择的调控。Shrivastav M,等细胞研究(2008)。PubMed
  • DNA双链断裂修复机制及其诱导染色体畸变的潜力。Pfeiffer P等。诱变(2000)。PubMed
  • 酿酒酵母双链断裂诱导重组的多条途径。Paques F和Haber JE。微生物学和分子生物学评论(1999)。PubMed
  • 较少人走过的路:提高同源定向修复(HDR)频率的策略,以提高CRISPR/ cas介导的转基因效率(2018)。Pubmed。

CRISPR引用:

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  • 老鼠遗传学家对CRISPR应用的实用指南。Singh P等。遗传学114.169771;(2014)。PubMed
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  • 利用CRISPR/Cas9系统优化基因组工程方法。Li, K等人。《公共科学图书馆•综合》9 (8);(2014)。PubMed
  • 在模型生物体中制造设计突变体。彭,y等。发展141;(2014)。PubMed
  • 使用不对称供体DNA,通过催化活性和非活性CRISPR-Cas9增强同源定向基因组编辑。Richardson CD等。Nat生物技术。34 (3);(2016)。PubMed
  • 使用单链DNA模板的高效同源定向修复。Jacobi SA等。海报2017年,在Keystone Precision Genome Engineering上。
  • easy -CRISPR:一种稳健的方法,使用长ssDNA供体和CRISPR核糖核蛋白一步生成携带条件和插入等位基因的小鼠。Quadros RM,等。基因组医学杂志。18个(1);(2017)。PubMed

注:Christina Mork对本文的更新做出了贡献。玛西·帕特里克和玛丽·吉尔林对本文的撰写有贡献。
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