CRISPR 101:哺乳动物表达系统和递送方法

由妮可Waxmonsky.

最后更新了Marcy Patrick 2020年9月30日。

CRISPR技术已被广泛用于基因组编辑目的,因为它比以前的编辑技术更便宜、更快、更容易。每个月都有越来越多的CRISPR工具发布,使CRISPR成为你下一个实验的伟大选择!

在本博客文章中,我们将提供一些CRISPR哺乳动物表达系统的概述,每个典型应用以及潜在的递送方法。

CRISPR-Cas9的关键成分:Cas9内切酶、gRNA、PAM和目标序列。CRISPR应用:基因组工程、转录调控等。

规划CRISPR实验的一般考虑因素

与任何实验一样,在规划过程中有许多因素需要考虑。对于CRISPR实验,以下框架可以帮助你开始:

  1. 确定你想要达到什么样的结果:你想永久地敲除或敲入一个基因?你想要启用或者抑制基因表达吗?你是想制造单点突变吗?你想要用报告蛋白创造融合如GFP ?所有这些结果都可以通过不同的CRISPR组件最有效地实现。
  2. 选择适合您的应用程序的CRISPR工具:Wildtype Cas9或Cas9 Nickase.适合用于产生淘汰或敲门,或引入突变和突变标签,而催化死亡的dCas9可与激活或抑制结构域联合使用来控制基因表达。基本编辑可以帮助你在gRNA靶位点附近进行精确的点突变。
  3. 选择合适的表达式系统和交付方法:您是否需要稳定的集成或瞬态表达式?您将编辑哪种细胞类型?您是否希望将组件作为DNA传递,或者mRNA或蛋白质递送更合适?
  4. 决定你要怎么做评估结果:您是否可以使用不匹配修复测定检测插入/删除?或者是PCR,然后是凝胶电泳和/或下一代测序更合适?
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如果您已经考虑过最终产品,则步骤1和2通常会很简单。同样对于第4步,因为这种关系直接回到您的特定目标。但是,在考虑第3步骤时,您可能会惊讶于可用的选项数量 - 您如何在它们之间选择?

第一个步骤之一是识别您需要提供的CRISPR组件。最微小地,任何应用都需要一个或多个SGRNA和CAS9。如果你想包括一个同源性定向修复(HDR)模板要创建敲门,点突变,或添加标签,您还需要提供供体质粒或单链DNA寡核苷酸,因此您需要确保您的表达系统和传递方法与您的所有兼容组件。

接下来,考虑基于您的模型系统的那些CRISPR组件的最佳形式。CRISPR试剂可以通过转染、核转染、病毒转导或以蛋白质、RNA或DNA的形式注射。最后,一旦你确定了最佳的表达系统,你就可以选择将这些CRISPR成分引入目标细胞的最佳方法。

哺乳动物CRISPR表达系统

每个模型系统都有自己的最佳实践,以高效地交付CRISPR组件。如果您是CRISPR或您的模型系统的新手,一个好的第一步是查阅文献,看看是否有人发布了适合您的系统的协议。Addgene已经存款人提交协议链接到CRISPR论坛您可以在哪里找到有关您选择系统的信息。下表总结了每个表达系统中包含的各种组件以及合适的应用程序。

表达系统 系统组件 应用
哺乳动物表达矢量 启动子驱动的Cas9表达可以是结构性的或可诱导的。U6启动子通常用于gRNA。可能含有报告基因(如GFP)来鉴定和富集阳性细胞或一个选择标记来产生稳定的细胞系。 Cas9和/或GRNA在哺乳动物细胞系中的瞬态或稳定表达,其可以高效率转染。
慢病毒转导 CAS9和GRNA可以存在于单一的慢病毒转移载体或单独的转印载体中。可以包含报告基因(例如GFP)以鉴定和富集阳性细胞。可能包含一个选择标记以产生稳定的细胞系。包装和包膜质粒提供制造慢病毒粒子所需的成分。 Cas9和/或gRNA在多种哺乳动物细胞系中稳定、可调的表达。用于难以转染的细胞类型,可以使用在活的有机体内。这是指挥的共同选择使用CRISPR进行全基因组筛选
AAV转导 只有兼容SACAS9.(包装限制〜4.5kb)。CRISPR元素插入AAV转移载体中并用于产生AAV粒子。 Saca9和/或GRNA的瞬时或稳定表达。感染分裂和非分裂细胞。AAV是最不毒性的方法在活的有机体内病毒交付。
Cas9 mRNA和GRNA 使用含有GRNA和CAS9的质粒在体外转录反应生成成熟的Cas9 mRNA和gRNA。通过微注射或电穿孔将RNA递送到目标细胞。 CRISPR成分的瞬时表达,随着RNA在细胞内的降解,表达减少。可用于产生转基因胚胎。
CAS9-GRNA核糖核糖蛋白复合物 纯化的Cas9蛋白质和在体外转录后的gRNA结合形成Cas9-gRNA复合体发表使用阳离子脂质的细胞。 瞬时表达Crispr组分,表达随着GRNA和Cas9蛋白在细胞内降解而降低。

哺乳动物细胞系的输送方法

如上所述,你在许多方面选择的表达系统决定了将这些CRISPR组件引入目标细胞的最佳方法。将这些成分传递到哺乳动物细胞系的方法非常广泛,包括几种不同的方法,因此我们总结了以下几种常见的传递方法的一些关键特征:

化学转染

脂质介导 阳离子聚合物 磷酸氢钙
细胞 转化细胞系 转化细胞系 转化细胞系
货物 核酸或蛋白质 核酸 核酸
吞吐量 高的 高的 高的
效率 媒介 媒介 媒介
困难 容易 容易 容易

物理转染

电穿孔/核原料 微调
细胞 很多类型 单个细胞
货物 核酸或蛋白质 核酸或蛋白质
吞吐量 高的 非常低的
效率 高的 很高
困难 很容易 非常困难的

病毒交付

慢病毒 逆转录酶病毒 AAV
细胞 划分或不生命 划分或不生命
货物 核酸 核酸 核酸
吞吐量 低的 低的 低的
效率 多变的 多变的 多变的
困难 难的 难的 难的

这些表格不包括所有方法,这些方法也不是在体外细胞培养的情况下限定的。用户应该回顾目前的文献关于他们的首选模型。

如果您的表达系统在CRISPR使用方面的表现不足,您将希望在优化和测试CRISPR交付​​效率方面投入一些时间。Addgene有几种质粒已发布为CRISPR测试工具:

交通灯记者系统:可以评估慢病毒组分递送以及基因组修复非同源终端连接(NHEJ)或HDR。

sgRNAs的EGFP验证:通过将基因组目标序列克隆到EGFP报告基因中,可以评估组件递送和sgRNA的有效性。

目标DNA记者系统:可以使用验证的工具评估组件递送。


特别感谢Joel McDade创建了Expression Systems表。Marcy Patrick对本文的撰写有贡献。

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