CRISPR 101:GRNA的多重表达

由玛丽传动装置

最初发布2016年1月28日,最后更新了詹妮弗·曾任2020年9月10日。云顶娱乐 韦德国际

CRISPR使得定位多个基因座变得容易——这个概念被称为多路复用。由于CRISPR是一个如此强大的系统,当你在一个质粒上添加多个gRNAs时,编辑或标记效率通常不会改变。听起来好吗?Addgene有很多工具可以帮助你进行多重复制-我们将使用哺乳动物质粒向你介绍一些潜在的选择和克隆方法,但请向下滚动适合其他模型系统的质粒,包括大肠杆菌、植物、果蝇,斑马鱼!

下载addgene的crisprup 101电子书!

为什么使用多路gRNAs?

通过在同一质粒上表达多个gRNAs,你将确保每个获得质粒的细胞包含所有所需的gRNAs。这增加了您想要进行的所有编辑的可能性。

多重gRNAs存在的原因有很多,其中一些是:

  • 使用双nickases生成淘汰赛或编辑。这有助于减少偏离目标的活动。
  • 通过去除两个靶位点之间的序列来删除基因组的一个大区域。
  • 立即改变多种基因。使用多路复用GRNA可以针对基因组中的多个位置进行修改,无论是编辑CRISPRI,CRISPRA还是基本编辑。

多路复用GRNA:基础知识

Addgene的资深科学家们经常遇到的一个问题是:我能否通过一个类似质粒的启动子表达多个gRNAPX330吗?不幸的是,简短的答案是否定的。除非你使用一个系统来处理一个连续的多gRNA转录本,否则每个gRNA必须从它自己的启动子中表达。但这并不意味着你必须克隆和转染多个启动子- grna来靶向多个位点!在本文中,我们将介绍Cas9多路复用选项,但也可以查看我们关于Cpf1多路复用的博文。


多重gRNA是指多个gRNA在一个结构中表达

让我们从最简单的多路复用开始:你只需要同时表达两个gRNAs。你可以使用的系统是pX333文图拉实验室。PX333,PX330的修饰,含有人源化的WTCAS9和两种U6启动子。为了使用这种质粒,您只需为您所选择的GRNA靶序列达到寡核苷酸,就像你一样克隆它们。您将使用限制酶Bsai使用限制酶BBSI和第二GRNA在第一GRNA中克隆。如果你在工作果蝇,双grna表达质粒可从中获取布洛克实验室,可以使用Gibson Assembly或SLIC克隆方法插入gRNAs。一个BsaI-based大肠杆菌多路复用质粒可从中获取Koffas实验室


用金门和吉布森组装方法放大多重gRNAs

如果你想增加质粒中gRNAs的数量,你需要使用一些组装方法,如金门或吉布森组装。

Grnas的金门组件

金门组装使用IIS型限制性内切酶,在其识别序列之外分裂,创造侧翼悬垂。可以对这些外延进行定制,以将多个片段链接在一起,从而允许将多个组件有序地组装成目标向量。

CRISPR / CAS9金门复用的第一步是克隆使用酶BBSI将每个GRNA靶序列指定的寡核苷酸克隆到不同的表达载体中。这些表达载体各自含有促进剂-GRNA构建体的型IIS限制性位点,但是邻近位点的不同序列。当用适当的IIS酶消化时,独特的侧翼突出序列可以链接在一起,以允许有序组装到表达CAS9的目的地向量中。这在下面的示意图中示出。

利用寡核苷酸克隆每个gRNA目标序列。然后这些单独的grna组装在一起成为目的地载体。

gRNA靶序列(有色矩形)通过寡核苷酸克隆到不同的质粒中。这些质粒包含IIS型酶切位点,它们位于启动子- grna的侧面。当这些质粒被消化时,与切割位点相邻的独特的悬挑部分(这里是O1-4)将片段“连接”在一起,并驱动有序组装成一个包含cas9的目的载体。注意:根据您使用的方法,过程将略有不同。

Addgene提供的两个金门选项遵循同样的组装原则,但它们针对不同的目的进行了优化。

Gersbach实验室多路复用质粒:

质粒组可以表达2-4个grna, 4个是理想数量。首先,生成4个独特的卡那霉素抗性质粒,每个质粒包含7SK、人类U6、小鼠U6或人类H1启动子下游的不同gRNA靶标序列。如果你表达少于4个gRNAs,你将在一个多终止序列中克隆每个未使用的启动子。此步骤是生成最后一个结扎步骤所需的所有悬垂部分所必需的。然后用BsmBI酶切质粒并连接到含有Cas9或dcas9的目的载体。目标向量选项包括人性化的wt Cas9,dCas9(转录抑制因子),dCas9-VP64(转录激活)含有质粒。每个目的载体都含有GFP,使您能够选择高GFP表达的细胞。这些细胞具有最高水平的Cas9和gRNA表达,因此基因组编辑事件的频率也最高。

山本实验室多重CRISPR/Cas9组装套件:

该试剂盒是为多路复用而设计的,用户可以表达多达7种gRNAs。根据你想克隆的gRNAs的总数,该试剂盒包含不同的目的地载体,从2-7。例如,如果你要表达4个grna,你会用pX330A-1x4;6个gRNAs,你会用pX330A-1x6。这种自定义意味着您永远不需要在填充序列中克隆。为了构建多路复用结构,你克隆了除一个之外的所有gRNAs到大观霉素耐药质粒pX330S-2至pX330S-(最后gRNA号)。最多5′的gRNA被克隆到包含cas9的目的载体中。这些构建物用BsaI酶切并组装生成编码gRNAs和Cas9的质粒。和Gersbach实验室质粒一样,可以使用多种CAS9变体: wt人源Cas9, D10Anickase突变(Cas9n),dcas9(转录镇压),和Fok1-dCas9(二聚的核酸酶)。

网关组装方法

免费实验室多重慢病毒表达系统(MuLE)试剂盒:

该试剂盒可用于创建表达wt人源化Cas9和多达3种gRNAs的慢病毒载体伟德BV下载。该试剂盒提供含有U6启动子和gRNA支架的进入载体。指定gRNA种子序列的寡核苷酸应与IIS型酶BfuAI相容。网关克隆然后将多个gRNAs和Cas9结合成一个质粒。虽然工具包中只提供了wt hCas9的输入向量,但您可以克隆自己的包含其他Cas9变体的输入向量,以便与MuLE系统一起使用。

从单个转录物中复用

你也可以通过多顺反子转录使gRNAs多重化。grna不是从不同的启动子转录,而是一起转录,两侧有特定的位点,允许它们被剪切和释放。这些结构体往往比具有多个启动子- grna盒的结构体更小,这使得它们有利于小容量载体,如AAV。除了下面描述的哺乳动物选项,用于制造多顺反子grna的质粒也可以从杨实验室用于植物。

哺乳动物多重系统使用CSY4 RNA核酸酶铜绿假单胞菌。当过度表达时,CSY4有效地切割GRNA夹在28个基础CSY4识别位点之间。如果没有表达CSY4,则无法释放GRNA,向系统添加时间和/或空间控制。pSQT1313Joung实验室允许您表达使用寡核苷酸组件构建的两种GRNA。与上述一些质粒不同,该载体不含CAS9,因此您需要用另一种质粒提供。

多种gRNA表达策略的比较。标准的Pol III gRNA盒对多路复用有很大的尺寸限制。Csy4可切割的盒较小,需要Csy4核酸酶的共表达。PTG盒有强大的gRNA表达,被内源性核酸酶裂解。
多路复用策略的比较,包括标准的PolIII-gRNA盒、Csy4-cleavable盒和PTG盒

在Addgene找到gRNA多路复用载体!

植物中多路复用

金门/吉布森组装多路复用质粒:

拟南芥的照片这些质粒允许你通过金门或吉布森组装2-4个gRNAs。使用BsaI将grna插入pCBC载体,PCR扩增启动子- grna片段,克隆到三种载体中的一种Zeamays密码子优化的Cas9的二进制矢量。该系统与单子叶床和Dicot植物兼容。

金门/吉布森组装多路复用质粒:

这些质粒在金门或吉布森组装后可表达多达8个gRNAs。利用BsaI将gRNAs克隆到12个包含多种启动子和报告子的pYLsGRNA质粒中的一个,然后插入到基于pCAMBIA的含cas9的目的载体中。Cas9是植物优化的,质粒可用于单子叶和双子叶植物,可以选择潮霉素或Basta。

杨氏实验室单转录多工质粒:

这些质粒与上面描述的Csy4多顺反子系统相似,除了它们使用内源性核酸酶系统来切割gRNAs。gRNAs的两侧是甘氨酸tRNAs,以产生多顺反子甘氨酸tRNA-gRNA (PTG)结构。真核RNases P和Z可以识别tRNA序列,并将其裂解,释放gRNAs。PTGs通过Golden Gate组装组装成含有cas9的wt载体,可以同时表达多达8个gRNAs。用于瞬时表达和农杆菌介导转化的载体已经获得。有关此系统的更多信息,请查看这个博客帖子

多路复用在斑马鱼

斑马鱼的照片陈文彪实验室金门组合多重质粒:

这些质粒允许在斑马鱼中表达2-5个gRNAs。自定义目标载体的使用取决于您希望克隆的gRNAs的总数,因此您不必克隆任何填充序列。你也可以选择加入一个先前设计的tyr gRNA,它会导致色素减退,从而标记经历过基因组修改的细胞。在这个系统中,Cas9必须供应在一个单独的质粒上。

多路复用的果蝇

果蝇的照片布洛克实验室多重质粒:

可以使用Gibson组装或斜线克隆组装两个GRNA。GRNA从两种果蝇U6启动子表达。CAS9必须在单独的质粒上提供。

多路复用的大肠杆菌

ecoli映像Koffas Lab Cislpatlbrick多重质粒:

该系统允许您组装II型用于基于DCAS9的转录抑制的CRISPR阵列。Ciscathbrick质粒含有两个粘性的间隔物,两个粘度均重复。可以使用BSAI消化垫片,允许插入间隔重复的“砖”。BSAI网站保持完整,允许随后的“砖”逐一添加。这种方法特别适用于组合分析。For example, if you were to develop an array using 3 distinct spacer-repeats, you could easily create 7 unique arrays (e.g. for spacers A, B, and C, you could obtain arrays A, B, C, AB, AC, BC, and ABC).

尼尔森实验室大肠杆菌CRMAGE质粒:

CRMAGE系统是一种快速,复杂的方法,可以结合CRISPR和基于重组的法验(多路复用自动化基因组工程)技术。pMA7CR_2.0表达分别由l -阿拉伯糖和无水四环素(anhydro四环素,aTet)诱导的lambda Red和Cas9。pMAZ-SK包含一个aTet诱导的gRNA和一个针对主干的gRNA盒,用于在l -鼠李糖和aTet诱导后通过“自毁”治愈质粒。CRMAGE比传统重组更高效,对于点突变有96-99%的效率,对于小插入有66%的效率。可同时复用两个目标,效率>70%。CRMAGE是一种非常快的协议,单轮编辑只需要5小时的潜伏期,后续的治疗协议只需要2-3小时的潜伏期。

Kondo实验室多路复用基本编辑E科利

近藤实验室表达胞苷脱氨酶融合Cas9与尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂与降解标签(LVA标签)实现特定点突变E科利。gRNAs在不同的质粒上传递,可以同时对6个不同的基因进行多重编辑。该系统不依赖于任何附加的或宿主依赖的因素,可以用于广泛的细菌。


下载addgene的crisprup 101电子书!

参考文献

1.马达洛,达尼洛等人。”在活的有机体内利用CRISPR/Cas9系统进行致癌染色体重排工程。”自然杂志516(7531)(2014):423-7。PubMedPMID:25337876。公共医学中心PMCID:PMC4270925

2. Kabadi,Ami M.等人。“从单一慢病毒载体的基于多路复用CRISPR / CAS9基因组工程。”核酸研究42(19)(2014):E147。PubMedPMID: 25122746。公共医学中心PMCID: PMC4231726

3. Sakuma,Tetsushi等。“使用一体式CRISPR / CAS9向量系统”人类细胞中的多重基因组工程。“科学报告4(2014年):5400. PUBMEDPMID:24954249.。公共医学中心PMCID:PMC4066266.

4.Albers, Joachim等人:“用于快速组合哺乳动物遗传学的通用模块化载体系统。”临床研究杂志125(4)(2015):1603-19。PubMedPMID:25751063。公共医学中心PMCID: PMC4396471

5.二聚体CRISPR rna引导的FokI核酸酶用于高度特异性的基因组编辑。自然生物技术32(6)(2014):569-576。PubMedPMID: 24770325。公共医学中心PMCID: PMC4090141

6.“一种用于植物多基因组编辑的CRISPR/Cas9工具包。”中国科学院植物生物学研究所,2014。PubMedPMID: 25432517。公共医学中心PMCID:PMC4262988.

7.马,兴良,等。“一种强大的CRISPR / CAS9系统,即在单子叶植物和单子植物中的方便,高效多重基因组编辑。”分子植物8(8)(2015):1274-1284。PubMedPMID: 25917172

8.谢卡宾,闵肯伯格,巴斯蒂安,杨宜农。“通过内源性trna处理系统提高CRISPR/Cas9的多路编辑能力。”国家科学院学报美国112(11)(2015):3570-5。PubMedPMID:25733849.。公共医学中心PMCID: PMC4371917

9.“利用Cas9和sgRNAs的转基因表达进行多重条件诱变”遗传学200(2)(2015):431-441。PubMedPMID: 25855067

10.端口,Fillip等。“优化的CRISPR / CAS工具,用于高效种系和果蝇中的体细胞基因组工程。”美国国家科学院院士USA 111(29)(2014):E2967-2976。PubMedPMID: 25002478。公共医学中心PMCID: PMC4115528

11.CRISPathBrick:用于大肠杆菌中dcas9介导的多重转录抑制的II-A型CRISPR阵列的模块化组合组装。中国生物医学工程学报2015年12月刊。PubMedPMID:25822415

12.Ronda, Carlotta等人(2016)。CRMAGE: CRISPR优化的MAGE重组。Sci代表。6:19452。PubMedPMID: 26797514

Addgene博客上的其他资源伟德体育中心

更多资源请访问Addgene.org

主题:CRISPR,1946伟德 伟德官网 ,CRISPR gRNAs

留下你的评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅