CRISPR 101:非同源最终加入

由Guest Blogger.

最后更新于2020年9月1日。

本文由北卡罗来纳大学教堂山分校的大卫·怀亚特和戴尔·拉姆斯登撰写。

使用CRISPR / CAS系统进行基因组工程的一个优点是CAS9可以容易地编程以在用户选择的情况下在基因组中进行DNA双链断裂(DSB)。在初始切割之后,过程中的下一步涉及修复染色体DSBS.。了解细胞拥有两条主要的修复途径是很重要的- - - - - -非同源端连接(NHEJ)和同源性定向修复(HDR)——以及这些路径是如何工作的,因为这可能与你的实验计划有关。在这里,我们将讨论NHEJ,以及它如何影响cas9介导的DSBs在基因组中发生的事情。

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非同源最终连接步骤

与HDR不同,NHEJ在整个细胞周期中都是活跃的,具有更高的修复能力,因为不需要修复模板(姐妹染色单体或同源物)或广泛的DNA合成。NHEJ还可以在几十分钟内完成大多数类型的断裂修复- - - - - -比HDR快一个数量级。因此,NHEJ是CRISPR/ cas9引入的断裂修复的原则手段。

无论端部结构如何,NHEJ的修复都需要以下因素,并决定了通路的主要事件:

  1. 破损的结束被加载所识别KU70 / KU80异质二聚体
  2. 然后Ku作为激酶招募的支架(DNA-PKcs)和一个双亚基DNA连接酶(XRCC4-LIG酶IV);再加上一些辅助因素(Paxx,XLF.),这个复合物将一对DNA末端连接在一起,形成一对末端复合物
  3. 然后将成对的末端复合物连接到兼容的DNA结束,从而修复断裂。

这是该途径的简化,流线型版本,并且不考虑对DSB的生物学来源共同的缺失或受损的核苷酸,并且需要处理。在连接之前进行处理,因为不相容的DNA结束干扰该步骤。因此,NHEJ具有巨大的处理因子工具箱,包括聚合酶(POLμ和POLλ),核酸酶(Astemis)和结构特异性的最终清洁酶(Aprataxin,TDP2),其能够使结束更好的基材用于连接。虽然我们这里没有描述这些步骤,但DNA结束的处理趋于是引入突变的点。

通过NHEJ修复Cas9诱导的休息

如下所示,如果目的是对你感兴趣的基因进行敲除,nhej介导的cas9生成的断裂修复是有用的,因为它容易产生indel错误。NHEJ在修复过程中产生的Indel错误通常很小(1-10 bp),但极不均匀。因此,大约有三分之二的机会引起移码突变。重要的是,当受到侧翼序列的序列恒等式(“微同源性”)的限制时,缺失的异质性更小。

非同源端连接

NHEJ没有义务介绍indels。鉴于Cas9 DSB的结束结构(没有核苷酸损伤的钝性或近钝端)这种产品很少见,可能占修复事件的不到5%。然而,在诱导产品的情况下,精确修复的产品容易重新切割,因此重复的循环将有利于后一种产品的积累。如上所述,单一的切割和精确修复的循环应少于一个小时,因此组成型表达目标CAS9的细胞群应在一天内大多数染色体中具有诱导。预期对修复的另一个因素是Cas9蛋白在切割后不会立即从断裂端释放,这可能会干扰Ku和正常的NHEJ活性。其他因素也可以影响NHEJ活动。例如,压制RECA和过度表达NHEJ机械改善了NHEJ准确性Smegmatis.(Yan等人,2020)。

NHEJ还可以使用规范Cas9方法的变体。一对位于有数百个碱基对或更多碱基对区域两侧的CRISPR向导可以同时引起一对染色体断裂,如果NHEJ将远端连接在一起,可能导致介入DNA的缺失(弹出式缺失)。同样,也可以通过nhej依赖的修复(“pop-in”插入)在Cas9靶向断裂(或对断裂)上直接插入外源DNA片段提供含有兼容突出的模板。CAS9也可以改变以产生目标单链断裂;当两个这样的断裂彼此接近时,在相对的股线中。这种“双缩乳”策略大大减少了偏移地点的突破和突变。

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Christina Mork贡献了这篇文章的更新。

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david_wyatt-guest_blog.

大卫·怀亚特是一名研究生,他的兴趣是确定断裂末端的结构如何影响它们的修复。他在戴尔的实验室工作。

Dale_Ramsden-guest_blog

戴尔·拉姆斯登是遗传学和分子生物学课程的成员,生物化学和生物物理系和北卡教堂山的莱恩伯格综合癌症中心。

参考

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关键词:结核分枝杆菌,crispr,非同源端连接,基因组编辑,基因编辑mBio 11:。https://doi.org/10.1128/mbio.02364-19



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