CRISPR极大地提高了科学家进行基因组改造的能力，带来了基因组工程的一场革命，新技术正在迅速发展。进行CRISPR实验至少需要交付两种成分:Cas9蛋白和靶向你感兴趣的基因组位点的引导RNA (gRNA)。这通常通过质粒转染细胞来完成，例如PX459，编码CAS9并包含插入自定义GRNA的站点。虽然这种方法已被证明对科学家令人难以置信的价值，但在使用此方法时必须考虑一些潜在的并发症：
- 必须允许细胞转染或病毒转导
- Cas9和gRNA的表达都必须选择合适的启动子
- 质粒DNA可以掺入基因组中
- 随着Cas9表达时间的延长，可能会发生脱靶效应
- CAS9转录和翻译延迟编辑的要求
什么是Cas9-gRNA核糖核蛋白?
一种替代方法，避免了许多并发症，是直接提供核糖核蛋白(RNP)由Cas9蛋白和靶向gRNA组成的复合物，针对你感兴趣的细胞。与基于质粒的Cas9/gRNA表达相比，Cas9 RNPs能够以类似的效率切割基因组目标，可用于目前CRISPR的大多数基因组工程应用，包括:生成单基因或多基因淘汰赛在多种细胞类型中，基因编辑使用同源定向修复(HDR)和生成大基因缺失。
Cas9 RNPS的优点是什么？
在CRISPR实验中使用rnp有很多优点。
- RNP方法常用于难以转染的细胞，如原代细胞。
- 使用RNPs还可以缓解常见真核启动子(如许多CRISPR质粒中发现的CMV或EF1A启动子)不表达的细胞中出现的蛋白表达困难。
- 由于这种方法不需要传递外源DNA，并且Cas9-gRNA RNP会随着时间的推移而降解，使用RNP可能会限制脱靶效应的潜力。
- Cas9 RNPs在转染后不久可检测到高水平，并通过蛋白降解途径迅速从细胞中清除。
- 这使得CAS9 RNP适用于CAS9所需的有限表达并且特异性是一个问题，例如敲除产生或同源重组。但是，需要Cas9长期表达的实验，例如使用荧光团标记的dCas9可视化基因组位点可能需要使用质粒或病毒介导的传递。
您已经决定使用rnp，现在该怎么办?
制备Cas9-Grna核糖核蛋白
这种CRISPR实验的第一步是产生RNP复合物的一代。虽然一个选择是从商业供应商购买Cas9蛋白和GRNA，但这通常是昂贵的。另一种方法是从中表达和净化他标记的CAS9大肠杆菌使用质粒如PET-28B-CAS9-他的从亚历克斯Schier的实验室。GRNA可以是在体外转录自ssDNA，可以由商业供应商如IDT.。然后这两种成分一起孵育形成RNP。概述这些步骤的详细协议已由雅各布玉米和亚历克斯Schier实验室。
交付Cas9-gRNA核糖核蛋白
使用RNP进行CRISPR实验的一个优势是可以使用多种方法来递送Cas9-gRNA RNP。这一优势使科学家得以进行研究在体外和体内实验系统中的CRISPR研究可能不适合基于质粒的方法。
递送RNP的最常见技术之一是电穿孔（上图中的A），其在细胞膜中产生孔，允许将RNP进入细胞质。除了在细胞培养中使用这种技术外，还通过称为称为的过程应用于小鼠Zygotes的基因组编辑CRISPR-EZ (脆R.R.NPE.lectroporation的Z.ygotes）（Chen等，2016)。在涉及HDR的CRISPR实验中，电穿孔可以与细胞类型的特异性试剂结合在一起，这种技术被称为核裂解，它在核膜上形成孔，允许DNA模板进入。
其他技术，如脂质介导转染(上图B)，还处于发展的早期阶段。David Liu的实验室已经演示了阳离子lipid-mediated方法将Cas9-gRNA RNPs传递到小鼠内耳毛细胞(Zuris等人，2015)。最近描述了一种使用rnp的更有针对性的方法在体外，希望最终能将这种方法用于体内应用程序。该技术利用Cas9蛋白质携带受体配体（C在上图中的C），这导致了特定细胞类型Cas9-GRNA RNP的内化（Rouet等。2018年)。这是使用Cas9突变体(Cas9M1C/C80S)完成的，该突变体包含两个表面暴露的半胱氨酸，包括天然的C547，允许与吡啶二硫基活化配体连接。
由于偏离目标突变和作物中的转基因整合的担忧，Cas9-gRNA RNPs到植物的交付作为质粒技术的另一种选择，这一直是一个紧张的研究领域。实现这一目标的两种方法是聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转染和未成熟胚胎的生物轰击(梁等人。2017年)。peg介导的方法虽然在技术上不那么困难，但往往表现出低效率，而生物轰击可以有很高的效率，需要专门的设备，如基因枪。根据实验的性质，由研究人员决定哪种方法最适合给定的实验。
rnp介导的CRISPR实验的考虑
在使用CAS9-GRNA RNP进行CRISPR实验的同时可以减少许多潜在的并发症，因此使用这些类型的实验考虑了其他因素。一个重要的考虑因素是CAS9-GRNA RNP随着时间的推移将被细胞降级。结果，RNP介导的CRISPR实验可能不适合于需要稳定的CAS9表达的实验，例如当将Cas9融合到荧光蛋白时用于标记核酸靶标。Cas9-Grna RNPS显示出来体内目前，对Cas9蛋白在宿主体内的免疫原性和稳定性知之甚少。事实上，研究已经表明Cas9蛋白来自Geobacillus stearothermophilus在人血浆中更稳定比标准spCas9 (哈林顿等人，2017)。最后，与任何科学研究一样，一种技术的选择通常会归结为研究员对不同系统的熟悉程度。在实验中使用CAS9-GRNA RNP可以需要蛋白质表达和纯化等步骤，这将需要额外的实验室试剂，设备和专业知识。
最终的想法
CAS9-GRNA RNP方法提供了科学家，具有额外的手段，以将CRISPR组件提供给他们的兴趣实验系统。使用这种方法可以减轻使用基于质粒的系统时可能出现的许多问题，最重要的是能够在难以转染或转染的细胞中进行CRISPR研究的能力。在使用CAS9-GRNA RNPS的同时可能需要在实验室中生产CAS9蛋白和GRNA，一旦获得了这些，可以迅速进行基因组编辑，在许多情况下，减少偏离目标效果的几率。随着CISRPR字段继续发展，rnps的使用可能会在其持续的进步方面发挥重要作用。
Andrew Hempstead是Addgene的高级科学家。安德鲁的兴趣包括基因组工程和微生物学。
参考文献
1.陈，肖恩，等。“通过CRISPR核糖核蛋白电穿孔的高效小鼠基因组编辑Zygotes。”生物化学杂志（2016）：JBC-M116。PubMed.PMID: 27151215。pmed中央PMCID: PMC4938170。
2。Zuris，John A.等人。“阳离子血液介导的蛋白质递送能够在体外和体内进行高效的基于蛋白质的基因组。”自然生物技术33.1(2015): 73。PubMed.PMID: 25357182。pmed中央PMCID：PMC4289409.。
3。Rouet, Romain等。受体介导的CRISPR-Cas9内切酶递送用于细胞类型特异性基因编辑美国化学学会杂志140.21(2018): 6596 - 6603。PubMed.PMID: 29668265。pmed中央PMCID：PMC6002863.。
4。梁，甄，等。“使用CRISPR / CAS9核糖核蛋白复合物的面包小麦的有效的DNA基因组编辑。”自然通信8(2017): 14261。PubMed.PMID：28098143.。pmed中央PMCID: PMC5253684。
5。哈林顿，卢卡斯等人。"耐热Cas9在人血浆中寿命延长"自然通信8.1（2017）：1424。PUBMEDPMID：29127284。pmed中央PMCID：PMC5681539.。
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