CRISPR 101:RNA编辑CAS13

由玛丽传动装置

玛丽传动

最初发布于2017年11月30日,并于2020年7月31日更新。

Cas13酶正迅速成为CRISPR领域的主要参与者。就在张峰实验室鉴定的一年后Cas13a (C2c2)(Abudayyeh等,2016)作为RNA靶向CRISPR酶,它们Cas13b用于精确的RNA编辑(Cox等人,2017)。这种新的系统被称为REPAIR(可编程A到I (G)替换的RNA编辑),是第一个用于RNA编辑的CRISPR工具。两年后,该实验室发表了一篇关于允许C - U编辑(RESCUE)的RNA编辑器的论文。我们将通过这些工具是如何开发和潜在的方式,您可以在您的研究中使用它。

RNA编辑优势

RNA编辑对更传统的DNA编辑系统具有多种优点;首先,RNA编辑不需要homology-directed修复(HDR)机械,并且因此可以用于非分配细胞。CAS13酶也不需要在目标轨迹处的PAM序列,使它们比CAS9 / CPF1更灵活。一些CAS13酶更喜欢具有给定单碱基原体侧翼位置(PFS)序列的靶标,但是Lwacas13a等矫形器不需要特定的PFS。CAS13酶不含负载DNA裂解的Ruvc和HNH结构域,因此它们不能直接编辑基因组。基于CAS13的RNA编辑系统可能是可逆的,并且会避免通过的基因组或indel非同源终端连接(NHEJ)

设计RNA编辑器

Zhang实验室设想了一种双组分RNA编辑器:Cas13酶与RNA腺苷脱氨酶(ADAR)融合。这种系统将腺嘌呤转化为肌苷,而肌苷在转译过程中就像鸟嘌呤一样。这种RNA编辑器将允许RNA的点突变,从而再现或拯救已知的致病等位基因,或引入一个过早的终止密码子,使RNA失去功能。

为了建立一个强大的RNA编辑器,实验室从Cas13支架开始,测试了多达21个Cas13a同源物、15个Cas13b同源物和7个Cas13c同源物。他们希望找到一种稳定折叠的同源物,它可以稳定地剪切RNA,而不像LwaCas13a, LwaCas13a必须通过单体超折叠的GFP来稳定,平均只有50%的RNA敲低。在最初的测试中,Cas13b来自PREVOTELLA SEP。P5-125(PSPCAS13B)产生62.9%的平均敲低,它们选择了这种酶进行进一步研究。PSPCAS13B不需要PFS,并且对来自30nt靶序列的碱基12-26的靶RNA中的不匹配是敏感的。

对于蛋白质的编辑部分,他们检测了ADAR1和ADAR2,它们在RNA中将腺苷脱氨成肌苷,产生了功能性的a - >g变化。他们将ADAR脱氨酶结构域(ADARDD)融合到dPspCas13b,但观察到低RNA编辑。为了增加A- >g编辑,他们使用了超活跃的ADAR结构,如ADAR2DD(E488Q)。他们还通过引入与目标a相反的C来调整引导RNA的结构。这种变化指定了gRNA间隔区存在多个a时进行的编辑,因为如果模板在该位置有胞嘧啶错配,ADAR将优先编辑腺嘌呤。

RNA编辑原理图。gRNA和dCas13b-ADAR2DD(E488Q)复合物一起结合靶RNA。然后在gRNA中错配的C位点上进行A到I的转换。I被翻译机构当作G来处理

PSPCAS13B-ADAR2DD(E488Q)显示出具有30-84个核苷酸的各种间隔长度的鲁棒编辑,并指定该系统修复方法。使用下一代测序,他们确认了一个 - > i编辑,发现50个NT间隔物增加编辑效率,但也增加了目标窗口内的偏离目标编辑,可能是由于长度的双工RNA延伸。使用ADAR2DD催化突变体,它们表明编辑由ADAR2DD介导,而不是PSPCA13b。

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测试和改进Cas13b REPAIR系统的RNA编辑

为了检测REPAIRv1的稳健性,本实验室从ClinVar数据库中筛选了34个致病性G- >a突变。他们在HEK293T细胞中成功编辑了33/34个位点,最高编辑效率为28%,使用RNA-seq进行评估。由于REPAIRv1机制太大,无法植入腺相关病毒载体,他们测试了截短的ADARDDs,看看能否缩小该结构。伟德BV下载他们鉴定出ADAR2DD(delta984-1090),该基因在不降低编辑效率的情况下,将REPAIRv1的结构尺寸从4473 bp减小到4152 bp。

虽然ReparyV1击倒比ShRNA敲低更精确,但它仍然显示出实质性的偏离目标活动。通过突变与双相RNA相互作用的ADAR2中的残基,希望使ADAR-RNA结合稳定,以降低偏离靶标。测试构建体,ADAR2DD(E488Q / T375G)(修理过佛)具有最高的目标编辑效率和最低的目标编辑量。在一项转录组范围的直接比较中,REPAIRv2将脱靶位点从观察到的18,385个减少到仅20个。

通过RESCUE扩展RNA编辑能力

两年后,Zhang实验室扩展了RNA编辑工具包,允许使用C到U进行编辑救援 (RNA.E为具体的c到u交换)系统编辑(Abudayyeh等人。,2019)。为了避免自然胞苷脱氨酶的RNA编辑的一些固有缺点,它们将腺嘌呤脱氨酶ADAR2DD进化到脱氨酸胞苷并使用DRANCAS13B(催化活性CA3)以靶向胞嘧啶脱氨酶。在接触RNA底物的ADAR2DD残基上进行三轮合理诱变导致15%的C-TO-U编辑活性。然后,它们在整个ADAR2DD上进行了十六轮定向演进,以进一步优化胞苷脱氨酶活性。虽然救援可以执行C-to-U编辑,但作者注意到它保留其腺嘌呤脱氨酶能力。

然后,作者测试了RESCUE系统编辑内源性转录本的能力,发现编辑效率高达42%。他们注意到,在30新台币的指南中,当C或U型基础翻转出现在目标基地对面时,RESCUE是最活跃的。然而,他们发现除了靶向的C-to-U编辑外,RESCUE在靶向核苷酸周围有A-to-I脱靶编辑。在这些脱靶编辑的对面,指南中引入鸟嘌呤不匹配有助于减少RESCUE的局部脱靶编辑。为了解决全转录组rna测序中观察到的C-to-U和a - To - i转录组范围内的脱靶效应,作者进行了理性突变,并发现了RESCUE中的一个S375A突变(命名为RESCUE-S)提供了~76%的目标C-to-U编辑,与RESCUE相比减少了~45%的目标C-to-U编辑和~94%的目标A-to-I编辑。

为了解决RESCUE在治疗上的潜在应用,作者测试了各种dRanCas13b的截断,这些截断可以将构造打包用于病毒传递。他们发现,在一个小到足以进行病毒传播的RESCUE系统中,c末端的截断使得同样或提高了编辑能力。

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未来发展方向

在以前的RNA上瞄准与CAS13的RNA,修复是第一个基于CRISPR的系统,以实现精确的RNA编辑。添加救援进一步扩展了可以编辑的RNA编辑工具包和序列。如上所述,编辑RNA的能力具有多种优点,包括可逆性和在非分割细胞中使用。通过使用两个系统的扩展靶向能力,作者期待扩展使用RNA编辑在研究中及其潜在的治疗用途

如果修复和救援可以以多路复用方式运行以编辑多个RNA,我们也很好奇。很明显,CRISPR RNA编辑将为科学研究开辟新的门 - 您将如何在研究中使用这些系统?


Cary Valley对本文的更新做出了贡献。

参考文献

Cox,David B.T.等。“RNA编辑用CRISPR-CAS13。”科学(2017): pii: eaaq0180。PMID: 29070703

Abudayyeh,Omar O.等人。“RNA瞄准CRISPR-CAS13。”自然550(7675)(2017): 280 - 284。PMID:28976959.

Abudayyeh,Omar O.等人。“C2C2是单组分可编程RNA引导的RNA靶向CRISPR效应器。”科学353 (6299) (2016): aaf5573。PubMedPMID:27256883。公共医学中心PMCID: PMC5127784

East-Seletsky,Alexandra,等。“CRISPR-C2C2的两个不同的RNA酶活性使能导向RNA处理和RNA检测。”自然538(7624)(2016):270-273。PubMedPMID: 27669025

Gootenberg,Jonathan S.等人。“用CRISPR-CAS13A / C2C2的核酸检测。”科学(2017): eaam9321。PubMedPMID: 28408723。公共医学中心PMCID: PMC5526198

East-Seletsky,Alexandra,等。“通过功能性正交型VI-A CRISP-CAS酶靶向RNA。”摩尔细胞。66(3)(2017): 373 - 83。PubMedPMID: 28475872

用于可编程单基RNA编辑的胞嘧啶脱氨酶。科学2019年7月26日,365(6451):382 - 386。PubMedPMID: 31296651

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