CRISPR / CAS9常见问题解答答案!

由卡洛琳LaManna

CRISPR CAS机制正如周二博客文章中提到的肯德尔,跟上最新的CRISP技术,他们的应用程序可能会耗尽。在Pubmed返回728篇文章(3/12/2014)中,快速搜索“CRISPR”,用于集群的短语,用于群集的短语返回的短文重复。对于CRISPR质粒工具和许多实验设计决策的许多选择,它有道理的是,科学家们认为,其中许多人是第一次冒险进入基因组的编辑,有很多问题。

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为了跟上这些问题的发展,丛乐博士和张峰博士开发了谷歌论坛,让科学家们可以随时提问并得到答案。但就像不断增长的PubMed文章列表一样使用CRISPR / CAS系统的基因组工程已经扩展了失控。为了进一步巩固这些常见问题解答,Le Cong与Addgene高级科学家Matt Ferenc致力于组织Crispr论坛最受欢迎的问题和答案。

这只是Crisp-Cas9常见问题的4个。如果在阅读这些后仍有更多问题,我们已经完成了12个Q&AS专注于基因组编辑使用张实验室的CRISPR / CAS质粒。

设计你的CRISPR基因组编辑实验

我应该在CRISPR基因组工程实验中使用wildtype还是double nickase ?

A1:当评估用于您的CRISPR基因组工程实验的Quidase类型时,请考虑野生型Cas9具有优化的嵌合GRNA具有高效率,但已被证明具有偏离目标效果。“双尼克赛”是一种新的系统,由张实验室开发,对优化的嵌合设计具有相当的效率,但具有更好的准确性(换句话说,降低偏移效果。

双缩酶系统基于Cas9 D10A缩短图4.cong,et。al,2013科学论文。例如,如果要使用双缩序,可以表达两个垫片和使用PX335表达CAS9N(Nickase)。

双乳酶系统的概念是您可以用CAS9酸碱表达两种不同的嵌合GRNA,其将以使用单个嵌合GRNA类似地引入靶位点的乳沟。同时,降低了偏离目标效果,因为Cas9酸缩酶没有诱导像野生型Cas9那样的双链断裂的能力。双缩乳系统有几个引用,包括最近来自张集团

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Q2:当设计用于将目标序列克隆成使用人类U6启动子驱动表达的主链的寡核苷酸时,是否有必要在目标序列的开头添加一个G核苷酸?

A2:人类U6子喜欢‘G’转录开始网站有很高的表达,所以添加这个G可以帮助表达,虽然仍然是质粒的表达未经G G .因为只有一个基地,张实验室时通常将其添加益生元。如果您的间隔序列以一个“G”开始,您自然有一个,而不需要添加一个额外的“G”。

Q3:可以使用CRISPR / CAS切除重组(HR)插入基因组中的最大DNA的最大DNA?同源武器应该有多长时间用于高效复合?

A3:到目前为止,我们最多尝试插入1kb。我们使用了800bp长的同源臂。

在实验台上使用CRISPR-Cas9的提示

Q4:在基因组中引入突变后,如何选择/筛选具有突变的细胞?

A4:在开始实验之前,请考虑与GFP共染色。这允许您对GFP阳性细胞进行排序,并丰富那些积极转染的细胞。或者,您可以使用选择标记来选择转染的电池(例如,具有嘌呤霉素抵抗盒的质粒,例如PX459)。当你将CRISPR/Cas系统与你的同源重组(HR)模板共转染后,你可以:

  1. 通过限制片段长度多态性(RFLP)来确认您的人力资源(见图4(Cong, et al, 2013 Science论文)。

  2. 如果你检测到阳性HR,分离单细胞菌落,培养它们,然后对每个菌落进行个体基因分型(例如使用Sanger测序),以筛选阳性的菌落。

- 或者 -

  1. 如果您的HR模板具有诸如嘌呤霉素的选择标记,则可以(也)通过嘌呤霉素选择选择正菌落。然后,您可以通过进行基因分型测定(例如Sanger测序)来确认纯化。
点击这里以供参考。

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