细菌的CRISPR方法:基因组工程,Crispra,Crispri,基本编辑等等

由玛丽传动装置

玛丽传动

最初发布于2016年3月3日,最后更新了4月13日,2021年By Will Arnold。

虽然在细菌中首次发现CRISPR系统,但大多数基于CRISPR的基因组工程已经发生在其他生物中。在许多细菌中,与其他生物不同,Crispr-诱导的双链断裂是致命的,因为非同源终端连接(NHEJ)修理途径不是很强大。在许多情况下,同源定向修复尚未有效地运作,但科学家们已经设计了共同噬菌体遗传系统的手段,以促进细菌中的同源重组。这些QUIRKS改变了CRISPR介导的细菌中的介导的基因组工程功能,但没有恐惧 - 来自加入存款器的质粒可以比​​以往任何时候都更容易使用CRISPR大肠杆菌还有其他细菌种类。继续读下去,了解细菌可用的工具和它们的一些应用。
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细菌CRISPR工程的开端

完成结合细菌基因组工程的一种常见方法重组,一种利用噬菌体重组机械来促进线性DNA片段的同源重组的技术。由于重组不包含用于成功修改的选择步骤,因此效率可以很低,特别是对于更大的修改。

如何解决这种效率低下的问题?使用CRISPR使它成为一个可选择的过程!由于NHEJ在细菌中无效,crispr诱导的双链断裂(DSB)是致命的。加入沉积物Luciano Marraffini的实验室利用这种致命性设计了第一个合成细菌CRISPR系统大肠杆菌。可从Addgene获得的系统由两种质粒组成:

  1. pCas9:耐Cas9和氯霉素
  2. Pcrispr.:携带靶向感兴趣的基因和卡那霉素抵抗的间隔物

大肠杆菌携带噬菌体重组机械首先用PCAS9电穿孔。然后,与寡核苷酸修复模板一起引入pcRispr。通过重组,兴趣轨迹被修改以匹配修复模板,并且轨迹不能被间隔衍生的CRRNA识别。但是,如果重组机构不成功并且野生型序列仍然存在,Cas9将切割感兴趣的基因,诱导致命的DSB。

如何使用Crispr用于细菌基因组工程

该系统与真核生物中使用的系统不同,CRISPR不是主要的编辑力量。相比之下,在大肠杆菌, CRISPR主要是一种选择手段,针对没有发生同源重组的细胞。强大的负选择系统保证了高编辑效率;只有没有经过编辑的细胞存活下来,Cas9或间隔序列发生失活突变,这些罕见的事件很容易用PCR检测到。该系统还在肺炎链球菌并且可用于同时生成多个突变(江等人。2013年)。

细菌的基因组编辑工具

CRMAGE系统结合了CRISPR和基于重组的MAGE

尼尔森实验室的CRMAGE系统是一种快速,复杂的方法,将CRISPR和基于重组的法师(多功能自动化基因组工程)技术(Ronda等,2016)结合在一起。PMA7CR_2.0.表达λ红色和Cas9,分别由L-阿拉伯糖和Anhydrootetracycline(atet)分别诱导。PMAZ-SK.含有ATET-IMICIBLE GRNA和骨架靶向GRNA盒,用于通过L-rhamnose和ATET诱导后通过“自破坏”来固化质粒固化。CRMAGE比传统的重组更有效,点突变效率为96-99%,小插入的效率为66%。效率> 70%同时可以同时复用两个目标。CRMAGE是一种令人难以置信的快速协议,单一轮编辑只需要5小时的孵育时间,以及随后的固化方案,只需要2-3小时孵育。

大肠杆菌T. Citro.无耻的编辑质粒

盛阳的实验室描述了一种两质粒系统,将重组与CRISPR结合在一起一个无疤痕,迭代的基因组工程系统(江等人,2015)。PCA.包含CAS9和噬菌体重组基因Lambda Red。Ptargetf.含有特异性GRNA,并且修复模板作为DSDNA片段提供。每一轮编辑需要两天,并且Ptargetf和PCAS质粒可以随后从细菌固化。虽然开发了大肠杆菌,该系统已成功应用于Tatumella citrea,另一个物种enterobacteriaceae.,无需修改。这一发现表明系统可以在最多的情况下是功能肠杆菌膜。

这个系统的更新,叫做Peccas / pecgrna.,允许它更多地使用E.杆菌包括流行的BL21(DE3)(Li等人,2021)的菌株。此PECCAS / PECGRNA系统与原始PCAS / PTargetF类似,但还有许多其他优点,包括更短的质粒固化时间。

pcrispomyces进行编辑链霉菌属

链霉菌属细菌产生各种各样的生物活性天然产品。在该属内轻松探索和工程师途径,惠民赵的实验室创造了两个“pcrispomyces”系统用于使用链霉菌属(Cobb等,2015)。Pcrispomyces-1包括Cas9,TracrRNA和CRISPR阵列,而Pcrispomyces-2包含Cas9和Grna盒。PcRispomyces-2的更简单系统显示更高的编辑效率,也许是由于其浓缩的设计。对于两个系统,可以使用BBSI轻松插入自定义垫片/ GRNA金门组件。可以使用Xbai进行质粒化,以插入额外的元素,如修复模板,使用吉布森组装或者限制性内切酶克隆。链霉菌属细菌更重组大肠杆菌因此,该系统的功能更类似于适用于真核生物的CRISPR/Cas9系统,即Cas9介导的剪切诱导HDR直接修饰给定的基因。

CRISPR-tranposons

通过结合CRISPR编辑和颠覆,Sternberg和Zhang Labs开发了Crispr-Transposons。斯特恩伯格实验室的系统称为集成(通过指南插入可转换元素,通过指南辅助靶向)和称为铸造(CRISPR相关的转座酶)的Zhang Lab的系统都能实现GRNA定向的转置。整合包括四种主要成分,包括(1)克隆,(2)四种蛋白质,形成Qcascade DNA靶向模块,其中CRRNA,(3)三转座蛋白,(4)供体DNA。通过使用多间隔仪阵列,可以多路复用CRISPR-TRASSPOSONS。

细菌的转录抑制(CRISPRi)

随着RNA干扰在细菌中不起作用,调节基因表达的大多数努力限于诱导型启动子或直接基因敲除。相比之下,CRISPR提供了一种更友好的方式来调节基因表达。马椰菜实验室齐实验室为大肠杆菌开发了早期系统;而马拉菲尼实验室使用本地最小CRISPR阵列(Bikard et al., 2013), Qi实验室聘请了一名基于GRNA的设计在真核生物中使用CRISPR的人更熟悉(QI等,2013)。如在其他系统中,靶向启动子或基因体的催化死(DCAS9)可以通过物理地阻断伸长型复合物与结合DNA或延伸转录物来抑制转录。不同的CA晶片和亚型函数略微不同,并且可以更有效地靶向启动子或编码序列和模板或非模板股,以及其他参数。。

Stanley Qi Lab的Crispri质粒

Stanley Qi的实验室证明了最小,不稳定的Crisp系统有效地沉默于大肠杆菌中的一种或多种基因的转录。在哺乳动物细胞系(Qi等,2013)。这种早期系统的两个重要特征是其可调节性质及其多重抑制的能力。使用TET响应式启动子以驱动催化死亡Cas9酶的表达允许基于诱导剂的存在,在这种情况下,在这种情况下允许可逆抑制Anydro-Tetracycline(ATC)。通过克隆在GRNA盒的两种串联拷贝中,可以同时可靠地敲低多个靶转录物的表达。

马露西尼实验室的Crispri /质粒

此外,早期工作的马拉菲尼实验室开拓性的基因组编辑使用CRISPR在细菌中,他们还领导了早期努力创造工具CRISPRi和CRISPRa(Bikard et al., 2013)。通过单独靶向催化死亡的Cas9 (dCas9)或融合到RNA聚合酶的omega亚基上的dCas9,该实验室成功地抑制或激活了大肠杆菌中选定基因的转录。此外,为了证明更广泛的适用性,他们证明了Cas9介导的抑制在革兰氏阳性细菌中的成功,肺炎链球菌肺炎料

罗伯特哈塞尼实验室m结核CRISPRI质粒

来自Husson实验室的一个小组使用CRISPRi研究结核分枝杆菌的必要基因。dCas9和一个gRNA表达于PRH2502pRH2521, 分别。DCAS9和GRNA都是TET诱导的,并且可以使用BBSI容易地将GRNA克隆到PRH2521中。该系统导致每种基因多个GRNA的80-90%RNA敲低(singh等。2016年)。

莎拉财富的实验室m结核CRISPRI质粒

注意到更常见的SPCAS9系统通常具有低效率,或者在分枝杆菌物种中使用时可以是蛋白质毒性,莎拉财富的实验室筛选了11个其他Cas9 Orthologs以鉴定更有效,耐受性的CAS酶。他们确定了Cas9 Orthologue嗜热链球菌,Cas9sth1作为转录沉默的鲁棒和高活性的酶结核分枝杆菌分枝杆菌Smegmatis.。除了鉴定出一种新的CRISPRi工具,他们还通过调节PAM进一步调整敲除效率来优化系统,并开发了新的、更严格控制的Tet响应启动子,以避免系统的泄漏激活。

革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的流动克隆

杰森·彼得斯奥伦罗森伯格, 和卡罗尔粗略使用了两种不同的遗传系统,靶向革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性的核心将Crispri带入更宽的细菌种类(彼得等,2019年)。系统的不同之处在于如何引入CRISPRI基因座(TN7以克阳性和ICEB1为单位),但共享用于靶向抑制基因表达的常见CRI-DCAS9系统。他们成功地在各种细菌中击倒了必需和非必要基因的表达,包括集合,基因组的格式。有兴趣了解更多吗?看看我们的移动CRISPRi博客文章

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CRISPR激活(CRISPRa)

虽然转录的激活是一个比抑制更具挑战性的问题,但科学家们已经沉积了几种可以以这种方式使用的质粒工具。如上面的Crispri部分所述,Marraffini Lab发布了一种强大的工具CRISPRi和CRISPRa使用RNAP-OMEGA-DCAS9融合。这是其他人。

基于SOX的Crispra.

在寻找CRISPR激活方法中大肠杆菌,Jesse Zalatan的实验室用过的一种方法鉴定参与转录活化的已知蛋白质包括转录因子、噬菌体蛋白和RNAP成分(Dong et al., 2018)。他们发现了一种名为SoxS的CRISPRa转录因子。为了增加复杂性,他们发现他们还可以包括用于多路调制的CRISPRi系统。

Sigma-54启动子的Crispra

注意到以前的细菌克里帕克的工作侧重于西格玛-70依赖的启动子,宝君王的实验室开发了一个可以的系统激活Sigma-54依赖性启动子(刘等人。,2019)。虽然Sigma-70启动子是普遍存在的,但它们不是普遍的,特别是当涉及非模型细菌时。作者能够将DCAS9变体设计成融合的σ-54型启动子所需的细菌增强剂结合蛋白。该系统在激活启动子中具有功能性假单胞菌含油克雷伯氏菌oxytoca

微生物工程

科学家们已经开始意识到CRISPR技术对人类微生物群的潜在影响。你可以把微生物群看作是占据肠道的生物体、它们的基因和代谢过程的集合。许多人类疾病与特定的生物体或生物体/基因与宿主的相互作用有关。

此方案允许多个潜在的CRISPR应用程序。首先,CRISPR可用于靶向致病或不期望的细菌的基因组中的位置。该系统可以多种方式递送,但是通过噬菌动物(Selle等人。,2020年Citorik等人。,2015年Bikard等人。,2014年)。当CRISPR系统以这些基因组位置为目标,并引入双链断裂,细菌无法解决它们,细胞就会死亡。

这可以应用于只有单一生物体存在的疾病,比如Clostridium艰难术,可以针对肠道的靶向和优先耗尽。虽然仍远离诊所,CRISPR-Cas3系统已经成功地用于小鼠的这一目的(Selle等人,2020年)

靶向人口中细菌的子集

LU实验室的工作发现使用CRISPR-CAS的早期成功靶亚群细菌(Citorik et al., 2014)。这些可能是基因,特定的多态性,包括抗生素抗性基因。当将噬菌体或可移动的质粒引入种群时,这种方法成功地针对特定的生物体。

设计蜜蜂肠道微生物群

除了人体肠之外,巴里克实验室已经沉积了可用于工程蜂肠道微生物组的质粒。他们创造了一个模块化系统使用了广泛的宿主范围的质粒这可以保持在原产于蜂蜜蜜蜂的细菌和肿块蜂肠道微生物的细菌中蜜蜂微生物组工具箱(Leonard等,2018)

基础编辑

利用CRISPR-Cas系统卓越特性的最新方法之一是碱基编辑。这一过程通常通过融合一种酶来完成,这种酶能够将一个碱基转化为另一个碱基,形成dCas9。然后使用典型的gRNA靶向方法将复合物导向一个特定的位点。这种方法提供了更细粒度的控制级别,可以修改单个基。

胞嘧啶核苷脱氨酶PmCDA1

Akihiko Kondo的实验室鉴定了一个细胞苷脱氨酶PMCDA1,可以融合到DCAS9和有效在靶序列中引入细胞苷至胸腺嘧啶取代(Banno等人,2018)。这些替换被限制在目标序列的大约5个碱基对窗口,可以通过改变sgRNA的长度进行调整。通过在融合蛋白上添加尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂和降解标记,可以进一步细化系统,以限制整个系统的活性。

假单胞菌胞苷脱氨酶

JI Lab带来了将此工具扩展到其他生物体基因组和基础编辑对假单胞菌种类(陈等人。,2018)。使用Cytidine脱氨酶,Apobec1和Cas9的酸酐酶版本,它们有效地引入点突变P. eruginosa,Pseudomonas普蒂达假单胞菌荧光, 和假单胞菌含油。这些载体含有易于克隆gRNA的BsaI位点。

链霉菌胞苷和腺嘌呤碱基编辑

一些最具工业和临床相关的细菌种类存在于Streptomyces属中,但基因组工程对属的大多数生物仍然挑战。从事太阳实验室证明了胞嘧啶和腺嘌呤基础编辑器的效用,即分别使C-TO-T和A-o-G基取代的替代品。替换似乎最有效的CAS9,但也可以使用DCAS9变体成功。此外,它们提供了进一步提高编辑速率的BE3的高保真(HF)变体。

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参考文献

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