细菌CRISPR方法:基因组工程,CRISPRa, CRISPRi,碱基编辑等

由玛丽传动装置

最初发表于2016年3月3日,最后更新于2021年4月13日,作者Will Arnold。

虽然在细菌中首次发现CRISPR系统,但大多数基于CRISPR的基因组工程已经发生在其他生物中。在许多细菌中,与其他生物不同,Crispr-诱导的双链断裂是致命的,因为非同源终端连接(NHEJ)修理途径不是很强大。在许多情况下,homology-directed修复尚未有效地运作,但科学家们已经设计了共同噬菌体遗传系统的手段,以促进细菌中的同源重组。这些QUIRKS改变了CRISPR介导的细菌中的介导的基因组工程功能,但没有恐惧 - 来自加入存款器的质粒可以比​​以往任何时候都更容易使用CRISPR大肠杆菌还有其他细菌种类。继续读下去,了解细菌可用的工具和它们的一些应用。
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细菌克里普尔工程的开始

完成结合细菌基因组工程的一种常见方法重组,一种利用噬菌体重组机械来促进线性DNA片段的同源重组的技术。由于重组不包含用于成功修改的选择步骤,因此效率可以很低,特别是对于更大的修改。

这种低效率的解决方案是什么?使用CRISPR以使其成​​为可选过程!由于NHEJ在细菌中无效,CRISPR诱导的双链破裂(DSB)是致命的。加入沉积物Luciano Marraffini的实验室利用这种杀伤力来设计第一个合成的细菌克里普尔系统大肠杆菌.Addgene提供的系统由两个质粒组成:

  1. PCAS9.:带Cas9和氯霉素抗性
  2. pCRISPR:携带靶向感兴趣的基因和卡那霉素抵抗的间隔物

大肠杆菌首先用pCas9对噬菌体重组装置进行电穿孔。然后,将pCRISPR和寡核苷酸修复模板一起引入。通过重组,将感兴趣的位点进行修饰,使其与修复模板匹配,该位点不能被间隔区衍生的crRNA识别。然而,如果重组失败,而野生型序列持续存在,Cas9将切割目标基因,诱导致命的DSB。

如何利用CRISPR进行细菌基因组工程

该系统与真核生物中使用的系统不同,因为CRISPR不是主要编辑力。相比之下,在大肠杆菌,CRISPR主要是选择靶向未发生同源重组的细胞的方法。这种强大的负选择系统可确保高编辑效率;唯一的未编辑细胞存活地具有Cas9或间隔序列中的突变,并且可以使用PCR易于检测这些罕见事件。该系统还在运用肺炎链球菌并且可以同时产生多个突变(Jiang等,2013)。

细菌基因组编辑工具

CRMAGE系统结合了CRISPR和基于重组的MAGE

尼尔森实验室的CRMAGE系统是一种快速,复杂的方法,将CRISPR和基于重组的法师(多功能自动化基因组工程)技术(Ronda等,2016)结合在一起。PMA7CR_2.0.表达分别由l -阿拉伯糖和无水四环素(anhydro四环素,aTet)诱导的lambda Red和Cas9。pMAZ-SK包含一个aTet诱导的gRNA和一个针对主干的gRNA盒,用于在l -鼠李糖和aTet诱导后通过“自毁”治愈质粒。CRMAGE比传统重组更高效,对于点突变有96-99%的效率,对于小插入有66%的效率。可同时复用两个目标,效率>70%。CRMAGE是一种非常快的协议,单轮编辑只需要5小时的潜伏期,后续的治疗协议只需要2-3小时的潜伏期。

大肠杆菌T. Citro.无疤编辑质粒

盛杨的实验室描述了一种两质粒系统,将重组与CRISPR结合在一起一个无疤痕,迭代的基因组工程系统(江等人,2015)。pCas包含CAS9和噬菌体重组基因Lambda Red。pTargetF包含特定的gRNA(s),修复模板作为dsDNA片段提供。每一轮编辑需要两天时间,pTargetF和pCas质粒随后可以从细菌中治愈。虽然发达国家在大肠杆菌,该系统已成功应用于Tatumella citrea,另一种肠杆菌科,无需修改。这一发现表明,该系统可能在大多数情况下都是有效的肠杆菌科。

这个系统的更新,叫做Peccas / pecgrna.,允许它更多地使用E杆菌菌株包括流行的BL21(DE3) (Li et al., 2021)。这种pEcCas/pEcgRNA系统的工作原理与原来的pCas/pTargetF相似,但有许多其他优点,包括更短的质粒固化时间。

pcrispomyces进行编辑链霉菌

链霉菌细菌产生各种各样具有生物活性的天然产物。为了方便地探索和设计这种植物的路径,惠民赵的实验室创建两个“pcrispomyces”系统用于链霉菌(Cobb等,2015)。Pcrispomyces-1包括Cas9,TracrRNA和CRISPR阵列,而Pcrispomyces-2包含Cas9和Grna盒。PcRispomyces-2的更简单系统显示更高的编辑效率,也许是由于其浓缩的设计。对于两个系统,可以使用BBSI轻松插入自定义垫片/ GRNA金门组装.这两种质粒都可以用XbaI线性化来插入额外的元素,比如修复模板吉布森大会或者限制性内切酶克隆。链霉菌细菌的重组能力比大肠杆菌因此,该系统功能更类似于CAS9介导的乳沟中适于真核生物的CRISPR / CAS9系统,诱导HDR直接修饰给定基因。

CRISPR-TRANPOSONS.

通过结合CRISPR编辑和转座子,Sternberg和Zhang实验室开发了CRISPR转座子。Sternberg实验室的系统被称为INTEGRATE(插入转座因子的引导rna辅助靶向)和Zhang实验室的系统被称为CAST (crispr相关转座酶)都能实现grna导向的转座。integration由四个主要成分组成,包括(1)一个CRISPR RNA,(2)与crRNA形成QCascade DNA靶向模块的四个蛋白质,(3)三个转座酶蛋白,(4)供体DNA。通过使用多间隔CRISPR阵列,CRISPR转座子可以多路复用。

细菌中的转录镇压(Crispri)

随着RNA干扰在细菌中不起作用,调节基因表达的大多数努力限于诱导型启动子或直接基因敲除。相比之下,CRISPR提供了一种更友好的方式来调节基因表达。马椰菜实验室气实验室开发了大肠杆菌的早期系统;虽然是马拉维尼实验室使用了本机最小的CRISPR数组(Bikard et al., 2013), Qi实验室聘请了一名gRNA-based设计更熟悉那些使用CRISPR的真核生物(Qi et al., 2013)。与其他系统一样,针对启动子或基因体的催化死亡(dCas9)可以通过物理阻止延伸复合物与DNA结合或延伸转录本来抑制转录。不同的Cas同源物和亚型功能有所不同,可以更有效地针对启动子或编码序列、模板或非模板链,以及其他参数。

Stanley Qi实验室的CRISPRi质粒

Stanley Qi的实验室证明了一个最小的、可调节的CRISPR系统有效地抑制了大肠杆菌中一个或多个基因的转录。和哺乳动物细胞系(Qi et al., 2013)。这一早期系统的两个重要特征是其可调节性和多重抑制的能力。使用Tet响应启动子来驱动催化死亡Cas9酶的表达可以实现基于诱导物存在的可逆抑制,在这种情况下是无水四环素(aTc)。通过克隆gRNA盒的两个串联副本,可以可靠地同时敲低多个靶转录本的表达。

Marraffini实验室的CRISPRi/a质粒

此外,早期工作的马拉菲尼实验室开拓性的基因组编辑使用CRISPR在细菌中,他们还领导了早期的工作,为CRISPRI和CRISPRA.(Bikard et al., 2013)。通过单独靶向催化死亡的Cas9 (dCas9)或融合到RNA聚合酶的omega亚基上的dCas9,该实验室成功地抑制或激活了大肠杆菌中选定基因的转录。此外,为了证明更广泛的适用性,他们证明了Cas9介导的抑制在革兰氏阳性细菌中的成功,肺炎链球菌肺炎料

罗伯特·胡森实验室的肺结核CRISPRi质粒

来自Husson实验室的一个小组使用CRISPRi研究结核分枝杆菌的必要基因。dCas9和一个gRNA表达于pRH2502PRH2521.,分别。dCas9和gRNA都是tet诱导的,gRNA可以通过BbsI轻松克隆到pRH2521中。该系统可导致每个基因的多个gRNAs 80-90%的RNA敲低(Singh等人,2016)。

莎拉财富的实验室肺结核CRISPRi质粒

我们注意到,更常见的spCas9系统通常效率较低,或者在用于分枝杆菌物种时可能具有蛋白质毒性,莎拉财富的实验室筛选了11个其他Cas9 Orthologs以鉴定更有效,耐受性的CAS酶。他们确定了Cas9 Orthologue乳酸链球菌Cas9sth1是一种高效的转录沉默酶结核分枝杆菌分枝杆菌smegmatis.除了鉴定出一种新的CRISPRi工具,他们还通过调节PAM进一步调整敲除效率来优化系统,并开发了新的、更严格控制的Tet响应启动子,以避免系统的泄漏激活。

革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的流动克隆

杰森·彼得斯奥伦罗森伯格,卡罗总使用了两种不同的遗传系统,针对革兰氏阴性菌或革兰氏阳性厚壁菌门将Crispri带入更宽的细菌种类(Peters等人,2019)。这两套系统在CRISPRi位点的引入方式上存在差异(革兰氏阳性的是Tn7,阴性的是ICEbs1),但在靶向抑制基因表达方面共用CRISPR-dCas9系统。他们成功地敲除了多种细菌中必需的和非必需的基因的表达,包括集合的,全基因组的,格式。有兴趣了解更多吗?看看我们移动CRISPRi博客文章

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CRISPR激活(CRISPRa)

虽然转录的激活比抑制更具有挑战性,但科学家们已经积累了几种可以这样使用的质粒工具。正如上面的CRISPRi部分所描述的,Marraffini实验室发布了一个健壮的工具CRISPRI和CRISPRA.使用RNAP-Omega-dCas9融合。这里有一些其他人。

基于袜CRISPRa

在寻找CRISPR激活方法中大肠杆菌Jesse Zalatan的实验室使用一种方法鉴定参与转录活化的已知蛋白质包括转录因子、噬菌体蛋白和RNAP成分(Dong et al., 2018)。他们发现了一种名为SoxS的CRISPRa转录因子。为了增加复杂性,他们发现他们还可以包括用于多路调制的CRISPRi系统。

来自sigma-54启动子的CRISPRa

注意到之前在细菌CRISPRa中的工作集中在sigma-70依赖启动子上,王宝军的实验室开发了一个可以激活Sigma-54依赖性启动子(Liu等,2019)。虽然西格玛-70启动子无处不在,但它们并不普遍,尤其是在非模型细菌中。作者能够设计一个融合到细菌增强子结合蛋白的dCas9变体,该蛋白是激活sigma-54型启动子所需的。该系统的功能是激活启动子Klebsiella催产症

微生物胺工程

科学家们已经开始意识到CRISPR技术对人类微生物群的潜在影响。你可以把微生物群看作是占据肠道的生物体、它们的基因和代谢过程的集合。许多人类疾病与特定的生物体或生物体/基因与宿主的相互作用有关。

这种情况允许一些潜在的CRISPR应用。首先,CRISPR可以用来定位致病性或不良细菌基因组中的位置。该系统可以通过多种方式传递,但已在噬菌体(Selle等人。,2020年Citorik等人,2015Bikard等人,2014)。当CRISPR系统靶向这些基因组位置时,并引入双链断裂时,细菌无法解决它们,并且细胞死亡。

这可以应用于仅存在单一生物体的疾病,例如艰难梭状芽胞杆菌,可以针对肠道的靶向和优先耗尽。虽然仍远离诊所,仅为这样的目的(Selle等,2020),Carp-Cas3系统已成功使用在小鼠中(Selle等,2020)

以群体中的一部分细菌为目标

LU实验室的工作发现使用CRISPR-CAS的早期成功靶亚群细菌(Citorik et al., 2014)。这些可能是基因,特定的多态性,包括抗生素抗性基因。当将噬菌体或可移动的质粒引入种群时,这种方法成功地针对特定的生物体。

设计蜜蜂肠道微生物群

除了人体肠之外,巴里克实验室已经沉积了可用于工程蜂肠道微生物组的质粒。他们创造了一个模块化系统使用了广泛的宿主范围的质粒这可以保持在原产于蜂蜜蜜蜂的细菌和肿块蜂肠道微生物的细菌中蜜蜂microbiome toolkit(Leonard等,2018)

基本编辑

利用CRISPR-Cas系统卓越特性的最新方法之一是碱基编辑。这一过程通常通过融合一种酶来完成,这种酶能够将一个碱基转化为另一个碱基,形成dCas9。然后使用典型的gRNA靶向方法将复合物导向一个特定的位点。这种方法提供了更细粒度的控制级别,可以修改单个基。

胞嘧啶核苷脱氨酶PmCDA1

近藤明彦的实验室发现了一种胞苷脱氨酶PmCDA1,它可以高效地与dCas9融合在目标序列中引入胞嘧啶到胸腺嘧啶的替换(Banno等人,2018)。这些替换被限制在目标序列的大约5个碱基对窗口,可以通过改变sgRNA的长度进行调整。通过在融合蛋白上添加尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂和降解标记,可以进一步细化系统,以限制整个系统的活性。

pseudomonas种类的胞苷脱氨酶

冀实验室将这一工具扩展到其他生物基因组和基础编辑对假单胞菌种类(陈等人。,2018)。使用Cytidine脱氨酶,Apobec1和Cas9的酸酐酶版本,它们有效地引入点突变P. eruginosa,Pseudomonas普蒂达荧光假单胞菌,.这些载体含有易于克隆gRNA的BsaI位点。

链霉菌胞苷和腺嘌呤碱基编辑

一些最具工业和临床相关的细菌种类存在于Streptomyces属中,但基因组工程对属的大多数生物仍然挑战。从事太阳实验室展示胞苷和腺嘌呤碱基编辑器的效用,使c到t和a到g碱基替换分别。当使用Cas9的nickase版本时,替换似乎是最有效的,但也成功地使用了dCas9变体。此外,它们提供了BE3的高保真(HF)变体,进一步提高了编辑率。

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参考

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