哺乳动物细胞系基因组缺失的CRISPR协议[视频]

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基因组 - 缺失 - 哺乳动物 - 细胞系 - 通过CRISPR-CAS9下面的帖子由Daniel Bauer和Matthew Canver提供贡献波士顿儿童医院和哈佛医学院Addgene很自豪地展示一个CRISPR文章的视频转载“通过Crispr / Cas9”从可视化实验(Jove)杂志中的哺乳动物细胞系中的基因组缺失。视频出版物Stuart Orkin.Daniel Bauer'sLabs详细说明了CRISPR / CAS9在哺乳动物细胞系中创造基因组缺失。Bauer和Canver下面讨论了这项研究背后的动机。

使用CRISPR / CAS9用于针对性基因组缺失

基于Kim和同事使用锌指核酸酶进行的实验,我们得到了产生染色体内缺失的灵感非同源端连接修复(NHEJ)[1]。我们最初的工作是与TALENs合作,与Porteus实验室[2]合作。随着CRISPR/Cas9的出现,我们开始在多种位点上探索DSB方法。我们对这种方法的效率感到惊喜。一个观察结果是,删除量与[3]的频率成反比关系。

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存在几种应用,其中通过配对的DSB产生删除可能特别有用。首先是对非编码调节元件的研究。通常基于相关性生化特征和异位报告分析来推断调节性DNA功能。我们一直有兴趣探讨在其天然染色质上下文中的非编码调节元件的功能。对成对的DSB删除的替代结果是反转[3]。这些重排段也可以是基因组功能的信息。

第二次使用针对性缺失是生产单方面的删除克隆。在给定基因座上的单个完整拷贝的细胞可能有助于研究臭氧水碎量。可以产生在删除边界内的剩余等位基因处的后续修改以产生克隆等位基因系列。

在编码序列上由NHEJ解决的单一dsb常常导致功能缺失的移码突变。然而,这些可能需要限制性片段长度多态性分析、等位基因特异性PCR、T7EN1裂解分析、测序、RT-qPCR或免疫印迹检测。另一种方法是使用成对的DSBs来定位单个基因内的两个外显子位点。该方法可用于常规PCR的缺失筛选。双等位分裂的细胞很容易识别。即使在单等位基因缺失的克隆中,未缺失的等位基因也可能产生indel或倒位突变[3]。

CRISPR时代,基因组景观可能被以前所未有的方式调查。靶向删除只是生物学家可以想象、创造和检查新的基因配置的许多可用策略之一。

观看以下视频学习丹尼尔和马修的程序。视频细节如何通过电穿孔将CRISPR质粒转染到MEL细胞中,通过FACS,底漆验证和PCR筛选转染的细胞进行双裂缺失克隆:

像视频?Orkin和Bauer Lab的相关论文描述了它们的CRISPR设计,克隆和交付的方法,以及用于创建删除的技术,识别这些删除以及最终表征。阅读并下载完整来自Jove文章的协议在Addgene的网站上找到更多的Carrpres资源。


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Dan-Bauer-PicDaniel Bauer是波士顿儿童医院和哈佛医学院的儿科血液学家和主要调查员。他的实验室研究了血细胞发育和疾病的分子遗传学。在他的网页上了解更多信息,bauerlab.org

Matthew-Canver-PicMatthew Canver是哈佛大学医学院的MD /博士学生,在Stuart Orkin和Daniel Bauer的实验室。他从宾夕法尼亚大学获得了生物工程的BSE

引用:

1. Lee Hj,Kim E,Kim JS。使用锌指核酸酶的人体细胞中有针对性的染色体缺失。Genome Res。2010年1月20日(1):81-89。PubMed.

2.Xu J, Fujiwara Y, Lin C,等。受遗传变异影响的BCL11A的红细胞增强体决定了胎儿血红蛋白水平。科学2013年10月11日;342(6155):253-257。PubMed.

3. Canver MC,Bauer De,Dass A,Yienyy,Chung J,Masuda T等人。聚集在哺乳动物细胞中介导的基因组缺失效率的表征。哺乳动物细胞中的核心细胞中的核心重复(CRISPR)/ Cas9核酸酶系统。j.biol.chem。2014年8月1日; 289(31):21312-21324。PubMed.

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