CRISPRainbow和基因组可视化

由玛丽传动装置

CrisPrainbow Multicolor标签多彩的CRISPR技术正在帮助研究人员可视化基因组及其在细胞核内的组织,也被称为4D核心。随着荧光的技术,可视化特定基因座历史困难原位杂交(鱼)和染色体捕获患有低分辨率,不能使用体内。一些研究人员已经使用荧光标记dna结合蛋白来标记特定的位点,但这种方法并不适用于每个位点…不像CRISPR。早期的CRISPR标记技术使研究人员能够可视化几乎任何单个基因组位点,而最近的进展使科学家能够随着时间的推移使用所有颜色来跟踪多个基因组位点CRISPRainbow

使用DCAS9可视化Genomic Loci In vivo.

CRISPR的灵活性提高了我们几乎每个基因组轨迹的能力,并这样做体内。催化死亡的Cas9 (dCas9)不能诱导基因编辑,但它保留了grna定向靶向的能力。通过使用gRNA将荧光标记的dCas9定位到给定的基因组位点,可以跟踪该位点在活细胞中的定位和运动!这项技术是在Addgene存库实验室开发的斯坦利齐和使用的陈等人。跟踪整个细胞周期的端粒动态。为了优化系统的信噪比,他们对GFP-dCas9和gRNA支架进行了修饰,以增强复杂的组装,从而减少未结合GFP-dCas9的背景荧光量。有了这些改进,标记效率与可比FISH方法相似。重要的是,当a.不存在gRNA或b.提供gRNA结合非哺乳动物序列(GAL4)时,他们没有观察到标记。

除标记重复的端粒序列外,陈等人。用内肾内和外源GRNA成功标记蛋白质编码基因。实际上,该方法足够且敏感,以检测基于观察到的荧光斑块数量的基因拷贝数。通过同时标记给定染色体的两个基因,它们还可以在2-75 MBP的距离范围内监测两个基因的空间关系。

标记多个染色体内位点

建立工作陈等人。Thoru Pederson的实验室用CRISPR以不同的颜色标记多个基因座。创建一个彩色Cas9工具箱,马等人。转向SPCAS9及其orthologs NMCAS9和ST1CAS9。将每个Orthologolog融合到不同的荧光蛋白中以产生三种不同的颜色。这些orthologs的特异性是关键:因为每个正序需要不同PAM序列,为一个dCas9设计的gRNA应该是特定于该同源物的,而不能与其他同源物串扰。

马等人。使用针对端粒序列特异的GRNA测试其DCAS9变体,并显示出不同的荧光标记的DCAS9s被有效地指向适当的靶序列。它们成功地使用特异于染色体9和13上的序列的GRNA标记了两对不同的染色体。它们接下来将注意力转化为映射成对的血管统计学基因座。该技术成功地解析了具有2和75 MBP的物理贴图距离的基因座,其中计算出的荧光距离与先前建立的物理图相相关。在比较〜2 MBP的比对,他们注意到它们即使对于这个小距离也可以评估染色质压实的程度!对于作者的知识,这项工作代表了第一次映射雄性统计学基因座,是表征4D核组的主要基准。

Crisprainkbow:缩放最多6种颜色+白色

颜色
蓝色的 MS2-MS2
绿色的 PP7-PP7
红色的 boxb-boxb.
青色 MS2-PP7
黄色的 PP7-boxB
品红 boxb-ms2
白色的 boxB-MS2-PP7

尽管Ma等人的成功。方法,荧光标记的Cas9具有许多限制。由于颜色由PAM序列指定,因此每种颜色都需要不同的Cas9 Ortholog,并且目标序列必须位于该PAM附近。为了扩大荧光克隆克定标签,他们采取了一种新方法:标记GRNA本身。

在他们的crisprainbow纸上,马等人。基因工程gRNA支架包含两个发夹序列,招募荧光蛋白BFP、GFP和RFP融合到各自的发夹结合域。伟德2021足球欧洲杯买球平台相同的发夹序列对指定原色蓝色、绿色和红色。相比之下,带有两种不同发夹的gRNA会产生青色、黄色或品红等次级颜色,这取决于发夹的组合,从而使单个颜色的总数达到6种。带有三个发夹的gRNA产生白光。所有6种gRNAs都可以在一个载体上表达,Pcrisprainbow-Donor1., dCas9由一个单独的向量提供。

CRISPRainbow颜色利用这彩虹般的颜色,Ma等人对活细胞中的多个染色体位点进行了复杂的跟踪。然而,他们注意到某些改进可以使CRISPRainbow更好。添加一个额外的发夹/荧光蛋白组合,例如,与远红色FP,可增加颜色到15!他们还设想将CRISPRainbow与基因编辑结合使用。CRISPRainbow需要非常短的,11-mer的gRNAs不要诱导基因组编辑。如果与催化活性Cas9一起使用,短的CRISPRainbow gRNA将允许标记,但一个新表达的标准长度gRNA将“切换”系统并诱导基因组编辑。这种系统以前曾被描述用于转录激活/抑制和基因组编辑。

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参考文献

1.陈,宝辉,等。“优化CRAC / CAS系统”生活人体细胞基因组基因座的动态成像。“细胞155(2013): 1379 - 1491。PubmedPMID:24360272。pmed中央PMCID:PMC3918502

2. MA,Hanhui,等。“人体细胞中染色体基因座的多色克切片标记。”Proc。Natl。阿卡。SCI。美国112(10)(2015): 3002 - 7。PubMed.PMID:25713381。pmed中央PMCID:PMC4364232

3.Ma, Hanhui,等。“使用CRISPRainbow多路标记dCas9基因座和工程sgRNAs。”生物科技Nat》。34(5)(2016):528-30。PubMed.PMID: 27088723。pmed中央PMCID: PMC4864854

4.“Cas9 gRNA工程用于基因组编辑、激活和抑制。”NAT方法。12(11)(2015):1051-4。PubMed.PMID:26344044。pmed中央PMCID:PMC4666719.

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