生成iPSCs的交付方法

由贝丝学会主席

诱导多能干细胞(iPSCs)研究领域已经走过了10年的历程。在此期间,科学家们使用了几乎所有可用的方法来生成诱导多能干细胞。诱导多能干细胞的生成在概念上是相对简单的:异位表达一组干细胞重编程因子,然后等待细胞去分化。然而,要决定使用哪种方法是困难的,特别是作为一个重新编程新手。这篇文章提供了重编程方法的简要概述,目的是帮助读者选择适合他们研究的策略。

寻找干细胞研究质粒

运输方式 机制 效率 安全 优点 缺点
MMLV衍生的逆转录病毒 集成 高效和稳定

基因组集成

插入突变,转基因活化,残留表达

慢病毒 集成 高效和稳定

基因组集成

插入突变,残余表达

Piggybac. 不易 中等的 中等的 生成无转基因和无载体细胞

基因组集成

需要序列单元格以验证切除未引入突变

腺病毒 Non-integrating 中等的

生成无转基因和无载体细胞

没有基因组整合

效率低下

仙台病毒 Non-integrating 中等的 中等的

生成无转基因和无载体细胞

没有基因组整合

从细胞中完全清除病毒会很困难吗
质粒 Non-integrating,通常 中等的 中等的

生成无转基因和无载体细胞

有限的基因组整合

需要多个转染

需要顺序验证是否没有基因组集成

复制EBNA1游离基因 Non-integrating 中等的 中等的

生成无转基因和无载体细胞

没有基因组整合

效率低下

需要验证史上剧集的损失

minicircle. Non-integrating 中等的 中等的

生成无转基因和无载体细胞

没有基因组整合

效率低下

需要验证minicircle的丢失

RNA交付 无DNA Transgene-free和vector-free 需要多个转染
蛋白质交付 无DNA 无转基因和无矢量。

慢且效率低下

难以纯化重编程蛋白质。

表1:生成IPSCS的不同方法的关键特征一个重要说明:在此表中,重新编程效率排名为低,中或高级是基于报告的重编程效率冈萨雷斯等。未列出百分比,因为许多变量(使用的单元格类型,使用的标准等)可以效果重新编程率和这样的数字可能误导。

集成IPSC交付方法

总的来说,整合病毒载体高效可靠地生成诱导多伟德BV下载能干细胞,但它们存在一些安全问题。首先,它们需要使用潜在有害的表达致癌基因的病毒颗粒,如Myc。伟德BV下载由于插入突变的风险,病毒载体在诱导多能干细胞生成方法中也有最大的基因组足迹。随机整合也会产生异质的诱导多能干细胞细胞系,这会使细胞系之间的比较复杂化。转基因的不完全沉默也是一个问题,而且分化后Myc或其他致癌基因的重新激活与此有关肿瘤形成ipsc来源的和ipsc移植的小鼠。cree - deleteable或Tet-inducible慢病毒解决了其中的一些问题,但是整体整合病毒系统目前缺乏翻译使用所需的安全性。

伟德BV下载

  • 逆转录病毒一些第一批诱导多能干细胞是用莫罗尼鼠白血病病毒(MMLV)衍生的逆转录病毒生成的。逆转录病毒伟德BV下载载体(例如PMX或PMSCV,感染除去细胞,并且与其他递送方法相比,产生IPSC的效率更高。逆转录病毒的克隆能力为〜8kb,因此单个多排载体或多个单基因载体可用于包装重编程因素。重新编程的重要里程碑是重编程转基因的沉默和相应的内源性多能基因的上调。逆转录病毒伟德BV下载载体容易受到重编程转基因的不完全沉默,这导致不完全重编程。另外,IPSC衍生细胞中的病毒转基因的延伸表达或重新表达可以干扰其分化电位。最后,逆转录病毒易于插入诱变和随机集成在IPSC克隆之间产生变化。妊娠病毒不被认为是安全的临床应用。逆转录病毒IPSC生成
  • 慢动力慢病毒载体伟德BV下载感染除去和非凡的细胞,并且具有比其他逆转录病毒载体更大的克隆能力(8-10kb)。伟德BV下载这使得可以使用表示由一个启动子驱动的多个重编程因子的多函数盒。虽然与MMLV衍生的逆转录病毒相比,慢病毒具有类似的重新编程率,但在重新编程后,它不会被压抑。通过使用TET诱导诱导病毒可以克服这一点,以允许对重编程因子的控制表达。查看帖子末尾的链接,以获取addgene可获得的TET诱导型重编程向量。另一个缺点是慢病毒载体插入每个转导电池中的不同遗传位置,因此伟德BV下载克隆之间存在不可避免的异质性。这可以使样品之间的比较复杂化,即转基因表达,因此重编程的程度可能受插入位置的影响。慢病毒插入还可以破坏肿瘤抑制基因和/或癌基因的表达,可能导致感染细胞中的癌症状表型的呈现。像逆转录病毒一样,慢病毒递送不被认为是安全的临床应用。Lentivirus IPSC代代
    • 可割取的
      • CRE-LOX.慢病毒载体伟德BV下载:该方法与使用标准慢病毒载体相同,但Cre重组酶的瞬时表达允许插入的loxP位点旁边的转基因基因的缺失。虽然在切除部位只有一个小的loxP疤痕,这种方法仍然被认为是不安全的治疗应用。

      • piggyBac (PB)转座子: 这PBrantposon.是一种可移动的遗传元素,通过“剪切和粘贴”机制在载体和染色体DNA之间转置。PB具有~9- 14kb的克隆能力。该系统作为含有转座子的供体质粒和表达转座子的辅助质粒被转染到细胞中。供体质粒包含目标基因的末端重复序列,PB转座酶识别。在重编程后,转基因可以通过重新表达转座酶来移除。利用PB生成诱导多能干细胞的一个挑战是,基因组的改变可能发生在转座子插入位点,因此需要序列验证。PB_v3

非整合IPSC递送方法

伟德BV下载

  • 腺病毒运载体伟德BV下载感染分裂和非凡的细胞并具有〜8KB的包装能力。通过这种包装能力,重编程因子可以作为单个多仲转基因或四种不同的腺病毒,每种表达一个因素。这些载体不会整合到基因组中,而是通过细胞分裂稀释而损失。这种方法的缺点是在生成IPSC时具有较低的效率水平,通常比逆转录病毒低几个数量级;然而,因为它们不太可能导致插入诱变,腺病毒载体被认为是表达治疗应用的重编程因子的更安全的方法。伟德BV下载Adenovirus IPSC生成
  • 仙台病毒载体伟德BV下载:仙台病毒是单股,负面意义RNA病毒。这是一个成员paramyxoviridae.病毒家族,其中还包括麻疹和腮腺炎Sendai转换了各种细胞类型并在细胞质上重复,无关的细胞周期。使用仙台的挑战是,由于它的复制竞争力,即使在许多段落之后,也难以消除所有细胞的病毒。Ban等人研制了一种对温度敏感的仙台病毒,在38℃培养细胞去除,但筛选细胞中是否存在转基因仍然是一个重要的控制手段。此外,仙台病毒不依赖启动子进行转录调控,因此需要不同的途径来调控转基因表达。看看萨诺等人要了解MicroRNA如何用于调节仙台病毒转基因表达。

瞬态游离交付

与集成方法相比,非集成方法具有更小的遗传足迹。这些方法消除了插入突变的风险,遗传伤疤的存在,和不完全沉默的转基因。总的来说,非整合方法比整合方法更安全,RNA和蛋白质传输被认为是最安全的,因为重编程因子的持续表达风险最小。

  • Non-replicating
    • 质粒:产生具有基于质粒的表达的IPSCs需要连续转染1或2个质粒,表达感兴趣的重编程因子。这种方法的优点是实现的方法相对简单,不需要耗时的病毒产生。理论上这是一种非整合方法;但是,在实践中可以发生一体化。okita等人描述了通过质粒转染产生IPSC的方案,其中2个克隆的2个具有质粒整合。另一个挑战是多次转染使得难以控制细胞在整个重编程时期接收细胞的剂量,并且当细胞主动分裂时,质粒将稀释。使用转染的典型缺点仍然存在:转染效率是细胞型依赖性,较大的质粒具有较低的转染率。

    • 小型:迷你圆就像迷你质粒。它们只包含一个真核启动子和要表达的cDNA(s),它们不整合或复制。它们的小体积导致更高的转染效率,由于dna沉默机制的低活化,它们往往比传统质粒表达更长的时间。虽然小圆圈通常比传统的质粒要小,贾等人使用一个~14.5kb的小圆表达a二肽由OCT4,SOX2,LIN28,NANOG和GFP报告组组成的多排序盒。通过用每个细胞划分稀释来从细胞中取出细胞,但仍然可以完全移除Minicircle的几个段落。
  • 复制
    • orip / epstein-barr核抗原-1(Ebna1)基于eBisomes:这些质粒携带来自eb病毒的复制起源(oriP)元件和顺式作用EBNA-1。EBNA-1结合oriP,允许质粒在哺乳动物细胞中复制,并协助将载体绑定到细胞的染色体上。通过添加一个可选择的标记,该系统允许oriP/EBNA1质粒作为一个稳定的染色体外DNA片段保持。与其他方法相比,重编程效率较低。这可能是由于质粒体积大,也可能是由于DNA甲基化导致质粒沉默。使用以EBNA1为基础的载体的另一个缺点是,质粒即使在选择被移除后也会停留一段时间。于等发现,来自EBNA1 IPSCS产生的亚克酮仍然存在剧目的DNA。质粒IPSC代

DNA-Free方法

  • RNA交付:对于这种方法,体外使用阳离子载体连续转染转录的RNA。以下合成修饰用于保护RNA免受针对SSRNA的细胞防御:磷酸酶处理,用5-甲基胞苷的胞苷替代胞嘧啶,和/或用假尿苷代替尿苷。使用RNA重新编程单元的关键优势是它简单富有效率。与其他方法相比,它具有高效率的重编程,即使与集成病毒方法相比,也是如此。它也有很高的安全标记。RNA IPSC代代成

  • 蛋白质递送:作为蛋白质的重编程因子是另一种避免将细胞暴露于外源遗传物质的方法。通过将它们融合给细胞递送至细胞,肽有助于介导其转导的肽,例如在中描述的polyarnine肽周等人金等。这被认为是一种更安全的方法,用于开发治疗应用,但它可能需要很长时间才能重新编程细胞。在Kim等人,每周将细胞暴露于重编程蛋白8小时,仍需要进一步培养以产生IPSC菌落。重编程效率也很低,难以净化进行这些实验所需的重编程蛋白质。蛋白质IPSC生成

用于IPSCS表征的分析

一旦生成IPSC克隆,重要的是要确定它们的表现形式。IPSC通常首先用基于分子的测定进行测试。这些方法不太严格评估多能性,但它们也花费更少的时间来完成。形态学是一种简单快捷的评估。IPSCS应形成具有大核,大核仁和小细胞质的细胞组成的紧凑型菌落。碱性磷酸酶的阳性染色,胚胎蛋白的表达和启动子去甲基化和内源多能性基因的表达(即OCT4)是重编程的其他措施。如果使用逆转录病毒,则该载体的沉默是另一种成功重编程的标记。

如果细胞含有重编程的分子标志,则通常以更严格的功能试验评估它们。细胞可以差异化体外为了形成胚状体,该体是松散有组织组织的紧凑型球,其表达所有三种胚层(Ectoderm,Mesoderm,Endoderm)的标志物。测量小鼠细胞的多能递通常涉及通过将IPSC注入胚泡并将其注入雌性小鼠来制备嵌合体。产生嵌合后代显示IPSC对所有三种胚层的能力有助于所有三种胚层,并且Chimaeras产生All-IPSC衍生的后代的能力证明了IPSCs形成功能生殖细胞的能力。小鼠IPSC,四倍体互补的最高严格测试涉及用IPSCS注入四倍瓣胚泡并测量它们指导鼠标发展的能力。

由于人类诱导多能干细胞无法进行这些功能测试,因此产生畸胎瘤的能力是黄金标准。畸胎瘤的形成需要向免疫缺陷小鼠注射诱导多能干细胞,并寻找包含所有三个胚层细胞的肿瘤。

选择重编程方法IPSC决策树

大多数IPSC研究分为两类:1)研究专注于更好地了解临床终点的重新编程和2)研究。在第一种情况下,IPSC的强大和高效生成是一个优先权,安全性较低。基因组整合较少令人担忧,因此病毒载体更适合这些情况。伟德BV下载第二种情况需要更高的安全水平,并且尽可能少的基因组改变的机会,效率是权衡。非整合方法,例如eBisomes,RNA递送和蛋白质递送更适合这些类型的研究。重编程的细胞也将影响结果,因为并非所有细胞类型都很容易获得,或者易于重新编程。基本上,没有通用方法可以处理IPSC的所有应用,但应该至少有一种方法可以帮助您解决您的研究目标。

你是新来的还是有经验的程序员?你有使用哪些方法的经验?请在下面的评论中告诉我们你的iPSCs经验!


参考文献

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方法从该参考文献调整数字。

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