easy - crispr:生成基因敲入和条件小鼠模型

由玛丽传动装置

CRISPR基因组编辑使得在各种物种中更容易地创建淘汰等位基因,包括标准实验室鼠标。它也是定向插入相对简单C. Elegans.细菌。但巧妙的典型鼠标模型,包括创造Cre-dependent条件等位基因,仍然是一个挑战。进入Easi.-CRISPR:一种利用ssDNA供体分子能量的方法同源性定向修复。使用Long SSDNA供体,古葫芦和OHTSUKA组已获得平均敲击效率为30-60%。这比以前的方法更有利,从而产生1-10%的敲入。阅读,了解如何使CRISPR鼠标模型生成easi -呃!

在CRISPR之前产生小鼠

常规基因打靶需要8-10个月,CRISPR基因编辑需要3个月这个过程产生敲击小鼠Pre-Crispr非常艰巨。首先,您可以用所需的变化,长同源性臂和选择标记构建质粒,然后将其电容到小鼠胚胎干细胞中。选择用重组产物选择克隆后,将微观注射到胚泡中以植入假孕雌性小鼠。如果您获得所需的嵌合小鼠,您将多次培育它们,希望产生具有所需编辑的鼠标。您还需要删除选择标记,可能是育种与鼠标线重组酶。如果你的嵌合小鼠没有包含编辑过的生殖细胞,你的实验就会失败。

CRISPR使小鼠模型生成的整个过程更简单,正如之前的一篇文章所描述的生成CRISPR鼠标模型。对于简单的敲除等位基因或点突变,常规基因靶向的8-10个月过程降至约2-3个月。但某些模型仍然难以制作。例如,大插入,如a荧光蛋白当使用标准的dsDNA修复模板时,它的效率很低。创造条件等位基因或浮动老鼠的最初设计来自杨等人。需要两个针对两个内文区域的GRNA和两个修复模板,以插入两个LOXP网站。由于制造了两个双链断裂,因此常常看到GRNA之间的区域的缺失。各种其他不良结果,包括一个LOXP网站插入和一个nhej修复的indel,经常发生。

单链DNA修复模板

已显示短单链DNA模板来提高效率同源性定向修复,研究人员假设它们可以通过HDR平底管有效地集成到DNA中。传统上难以生产长期的单链DNA,但是Miura等人。(2015)开发了IV.改善这个问题的TRT方法。简而言之,您设计捐赠模板以包括左同源臂的上游的T7启动子,进行体外转录,并使用IVT产品作为模板进行逆转录,以创建SSDNA。请注意,T7启动子不会包含在最终的SSDNA模板中。

IVTRT概述生成SSDNA修复模板

尽管有效,IV.TRT对具有复杂二级结构的序列可能更具挑战性。今天,多家公司提供长期的单链DNA生产服务或套件,包括Idt Megamer.服务测试Quadros等人

在提供SSDNA模板和CRISPR机械时,Quadros等。推荐核糖核蛋白(RNP)复合物Cas9蛋白和分离的引导RNA成分(crRNA和tracrRNA)最大Easi -CRISPR效率。Easi.-CRISPR与用于小鼠转基因的标准显微注射和电穿孔方法兼容。

设计A.Easi.-crispr敲门等位基因

要在特定位置设计敲击等位基因,您需要只设计一个指南和捐赠者SSDNA。在这里,我们将使用将2A-FLPO盒式磁带插入到的示例FGF8.基因。Miura等人。(2018)建议使用所需插入站点周围的50-80bp序列来搜索潜在的GRNA。与其他同源导向的修复实验一样,您希望导向部位尽可能接近您所需的插入位点,以最大化HDR效率。在这种情况下,我们很幸运能够在停止密码子之前直接发作的指导!

如何用Easi-CRISPRi设计c端插入

设计您的修复模板55-100碱基同源臂的上游和下游插入位点。如果您正在使用IV.TRT法,试做左同源臂的前两个碱基鸟嘌呤(即GG);该设计已被证明可以提高T7启动子活性。为避免Cas9编辑后重新剪切,请确保修复模板中不包含野生型gRNA靶位点和相邻的PAM。你的基因敲入设计可能会自然地去除gRNA序列或将其放置在远离PAM的地方;如果不是,您可以添加一个沉默的PAM或引导突变。

设计A.Easi.-CRISPR条件等位基因

浮动条件等位基因的设计要求你在0.5 - 0.8 kb间隔的内含子区域靶向2个loxP位点。在下面的例子中,我们将添加loxP位点用于条件删除的第6外显子SYT1.,模仿先前制作的鼠标模型。为了避免破坏剪接供体/受体位点,Miura等。(2018)推荐目标站点在任何一方的目标外显子上至少100亿。它们已成功使用针对相同或互补股线的导轨,以及面向或远离彼此的引导件。

Easicrispr4final.

如在敲门式示例中,您将在每侧设计55-100 BP同源性的维修模板。为了最佳修复,请将LOXP站点精确放置在每个导向器的切割位置。该设计还将GRNA靶序列与它们的PAM分离,防止在编辑后重新切割。

如何使用addgene质粒Easi.-Crispr.

如何使用addgene质粒设计Easi-Crypr修复模板

您可以使用addgene质粒来创建维修模板!如果具有具有所需插入特征的质粒(例如,荧光蛋白),则可以使用含有含有同源臂的引物在一端的底臂和T7启动子的引物放大所需区域。通常,Easi.-crispr最适用于2 kB或更少的插入。幸运的是,大多数常用的盒子,如荧光蛋白(EGFP,MCHerry等),重组酶(CRE,FLP等)和四环药物诱伟德2021足球欧洲杯买球平台导系统(TTA或RTTA)的长度在1至2kb之间。有大量的addgene质粒选项用于模板 - 请参阅右侧使用蓝色的火焰质粒pmsca​​rlet_c1.!!创建T7-DNA模板后,您可以使用IV.TRT创建如图2中所述的SSDNA构造。

您还可以使用Addgene质粒来纯化Cas9蛋白。下表包含了我们的一些最爱,所有这些都有蓝色火焰

质粒ID

质粒名称

标签

69090.

pMJ915

MBP (N终端);6 xhis (N终端);2 xnls (C终端)

47327

PET-28B-CAS9-他的

6 xhis (C终端);NLS(C终端)

62933

PET-CAS9-NLS-6XIS

6 xhis (C终端);NLS(C终端)

62934

PET-NLS-CAS9-6XHIS

6 xhis (C终端);NLS (N终端)

Easi.-crispr效率和递送方法

使用RNP交付和显微注射,效率Easi -简单的敲门和浮动模型的CRISPR占幼崽的8.5-100%,典型效率为30-60%。Quadros等。将大部分变化属于指导RNA效率的差异。例如,在双指导浮动实验中,如果一个引导件少有效地切割,则可以观察到部分插入。目标基因座的染色质结构也可能影响效率。但是,Quadros等人。看到成功Easi.-31个项目的三个独立核心设施 - 大多数项目需要只需要40-60个Zygotes来生成正确编辑的创始人。

用于I-Gonad的设备的卵巢和输卵管解剖图

研究小组负责Easi.-CRISPR最近也得到了发展一世-Gonad作为一种简单的方法,用于将基因组编辑组分交付给种系。与标准的显微注射相比,一世- 使用小切口直接在怀孕的女性小鼠上进行,该小切口暴露卵巢和输卵管。在将溶液注入输出腔后,镊子型电极放置以介导电穿孔。

ohtsuka等。比较传统的显微注射和一世- 使用小型SSDNA敲击效率,他们发现了可比的效率(52 vs 49%)。相比之下,Easi.使用长ssDNA供体的-CRISPR的效率较低一世-Gonad(15%)与显微注射递送(25-67%)。但是,显微注射确实需要比...更多的动物需要2.5倍一世- 戈纳德,是一个更加技术上艰难的过程。总的来说,主要的缺点一世-Gonad是它需要高浓度,柱纯化的DNA模板。


非常感谢Channabasavaiah B. Gurumurthy, Masato Ohtsuka和Rolen M. Quadros帮助编辑这篇博客文章。

参考文献

杨,慧,等。“通过CRISPR / CAS介导的基因组工程携带报告和条件等位基因的一步生成。”细胞154(2013):1370-9。DOI:10.1016 / j.cell.2013.08.022pubmed:PMID:23992847pmed中央PMCID:PMC3961003.

Miura,Hiromi,等人。“通过较长单链DNA的人工小罗脉的内含微润罗纳的克拉克/ Cas9基础的敲低小鼠。”科学培训。5(2015):12799。DOI:10.1038 / srep12799PubMed.PMID: 26242611pmed中央PMCID:PMC4525291.

Quadros,Rolen M.等人。“EASI-CRISPR:使用LONG SSDNA供体和CRISPR核糖核蛋白携带条件和插入等位基因的小鼠一步生成的鲁棒方法。”基因组Biol。18(2017)(1):92。DOI:10.1186 / s13059-017-1220-4PubMed PMID: 28511701pmed中央PMCID: PMC5434640

Miura,Hiromi,Rolen M. Quadros,Channabasavaiah B Gurumurthy和Masato Ohtsuka。“EASI-CRISPR用于使用LONG SSDNA捐赠者创建敲入和有条件的淘汰鼠标模型。”NAT PROTOC。13(2018)(1):195-215。DOI:10.1038 / nprot.2017.153PubMed.PMID:29266098

Ohtsuka,Masato等。I-Gonad:使用CRISPR核酸酶原位种系基因组工程的鲁棒方法。基因组Biol。19(2018)(1):25。DOI:10.1186 / s13059-018-1400-xPubMed.PMID: 29482575pmed中央PMCID:PMC5828090.

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