教学平面图工具教学发展生物学技术

由Angela Abitua.

科学家常规使用技术来改变基因表达或标记特定的细胞,但资源太少,以教授学生在开始时如何执行这些实验。在大多数课堂上,实验室经验专注于古典胚胎技术,如基本观察和解剖。学生通常不会在遗传学或分子生物学中表现出更多的现代技术,因为实验要么无法对业余科学家提供或过于挑战。普林斯人,常见于淡水池塘中常见的蠕虫生物,对这个问题提供了良好的潜在解决方案。刨平底花师很容易购买,培养,并具有有趣的表型来学习。除此之外Sánchez实验室利用最近的质粒沉积使得在真涡虫身上进行先进的发育生物学实验变得更加容易。

这些质粒使两种主要类型的实验:

  • 所有的原位登上杂交(希望)用于基因表达的可视化。
  • 双链RNA (dsRNA)介导的RNA干扰(RNAi)可以抑制特定基因的表达。

储存的49个质粒使学生能够研究四种廉价和商业上可买到的真涡虫的基因表达和与再生相关的关键基因的功能:Girardia sp., Dugesia dorotocephala, Phagocata morgani,和Phagocata gracillis。有11个不同的基因被克隆到质粒中去研究每一个涡虫物种。

这些质粒都有PR-T4载体骨干,这是一个改进版本L440。这种载体是多功能的,它可以用于原位杂交和dsrna诱导的RNAi实验。值得注意的是,该质粒在T7启动子的两侧有一个多克隆位点,可以双向转录生成dsRNA。学生可以通过PCR从相同的质粒上分离出DNA模板,并使用它们创建用于原位杂交实验的核糖体探针。

最近出版的刊物[1],介绍了WISH和RNAi实验所需的质粒和协议,以及如何进行蠕虫截肢。他们还创建了一个名为旷课它提供了更详细的材料和协议资源。

找到Sánchez lab plasmid

通过整体安装可视化基因表达原位杂交(希望)

希望是一种检测组织中mRNA转录物的时间和空间定位的技术。这对于标记特异性细胞类型并查看基因表达如何通过时间或遗传操作之后进行改变。该技术涉及使用合成制备的RNA(核心体)与改性核苷酸(例如,Digoxigenin标记的尿嘧啶),其将结合胚胎或组织内的互补mRNA。一旦产生核糖制素,希望方案涉及制备组织样品,几次洗涤和温度变化以可视化特定基因的表达。在核司瓣结合(通过杂交)检测mRNA - 核糖骨络合物的特异性抗体后,将添加到组织中。最后一步涉及化学反应,以染色含有该mRNA-rebopopobe-antids络合物的细胞,结果这些细胞变为蓝色。

学生可以从线性化的DNA模板中合成核糖体探针,通过PCR可以很容易地从环状质粒中生成。通常,为了构建这些结构,发育生物学家必须从他们感兴趣的生物体中提取RNA,用RNA制造互补DNA (cDNA),然后使用PCR和分子克隆将cDNA插入所需的质粒主干中。Sánchez实验室质粒允许学生和新实验室绕过这些步骤,专注于WISH技术。在Sánchez实验室出版物[1]中描述了11种不同涡虫基因的表达模式(所有这些基因都可以通过沉积物获得),以便进行这些实验的学生有一个良好的基线进行比较。执行希望利用这些质粒可以标记涡虫的特定细胞类型或整个器官。例如,基因匹威标记成细胞和基因预惯量转换酶2(PC2)标签中枢神经系统。

通过RNA干扰(RNAi)评估基因功能

RNA干扰(RNAi)是执行兴趣基因的有针对性的敲毁的强大工具,并首先被发现并以无关的蠕虫(秀丽隐杆线虫)[2]。匹配特异性mRNA序列的匹配的DSRNA触发了级联事件,导致靶mRNA的降解并使其表达沉默。更具体地,在RNAi的过程中,将酶被称为DICER切割或“骰子”dsRNA成较小的大块。这些较小的dsRNA片段称为小干扰RNA(siRNA),它们与一类蚁长型蛋白质结合。Argonaute蛋白去除siRNA的一条链,并通过互补的单链siRNA互补,以结合本地表达的MRNA。随后通过Argonaute催化的核酸酶活性或通过翻译机械的物理阻塞破坏的天然MRNA。

在Sánchez实验室协议中,dsrna通过喂食真涡虫来传递。根据你所研究的真涡虫种类,协议将略有不同。例如,吉拉德亚州sp。Dugesia dorotocephala可以喂食dsrna表达大肠杆菌和肝酱混合。在和肝酱混合之前,这些大肠杆菌通过诱导T7聚合酶(T7 polymerase, T7)激活dsRNA的表达大肠杆菌基因组(通常由IPTG控制)。为了让这种iptg诱导的表达起作用,学生必须使用一个商业广告大肠杆菌应变,指定为DE3

Phagocata morganiPhagocata Gracillis.,这个过程有点复杂。这些菌株都是挑食者,拒绝食用混合的肝膏大肠杆菌。从而使dsRNA进入Phagocata morganiPhagocata Gracillis.,人们必须从细菌中纯化DSRNA,并将纯化的DSRNA与肝脏浆料混合,并将混合物喂给蠕虫。

RNAi敲低处理的表型在三次双链rna喂养后应该是明显的。有些表型直到截肢后才明显。例如,在截肢后的真涡虫中,贝塔-连环蛋白被击倒后,可以观察到戏剧性的“双头”表型。其他基因靶点不需要截肢就能被发现。例如,odf2基因敲低会导致可观察到的“响尾”表型,从而破坏野生型的运动。

大肠杆菌可用于将dsrna传递给真涡虫进行RNAi

创造你自己的质粒来研究真涡虫的其他基因!

对于那些有兴趣进行自己的分子克隆和未在该系列的研究的人的人来说,它们可能克隆DNA序列以将核毛体和DSRNA产生为PR-T4P。桑切斯实验室协议还为“勇敢和更加好奇”的学生提供了如何克隆感兴趣的基因进入空的PR-T4P载体骨干的逐步说明。

空向量PLL4,类似于PR-T4P,可从Addgene获得。

如果您使用这些已发布的协议并希望共享图片,反馈等。请写信cuttingclass@stowers.org如果你制造新的质粒来研究不同的涡虫基因,我们鼓励你这样做把它们放回Addgene并扩大其他教室和研究人员可以轻松调查平面图的基因数量。


参考文献

1. Alice Accorsi,Monique M. Williams,Eric J. Ross,Sofia M. C. Robb,Sarah A. Elliott,Kimberly C.Tu,AlejandroSánchezAlvarado,《美国生物老师》,卷。79 2017年3月3日;(第208-223页)。关联:http://abt.ucpress.edu/content/79/3/208

2.Fire, S. Xu, M.K. Montgomery, S.A. Kostas, S.E. Driver, C.C. Mello。双链RNA在秀丽隐杆线虫。大自然,391(1998),第806-811页。PubMedPMID: 9486653

3.纽马克,菲利普A.等。“摄入细菌表达的双链RNA抑制平面图中的基因表达。”美国国家科学院院刊One hundred.增刊1(2003):11861-11865。PubMedPMID:12917490。公共医学中心PMCID: PMC304099

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