CRISPR 101:利用CRISPR/Cas9工程植物基因组

由Joel McDade.

最初发布于2016年10月11日,最后由Benoit Giquel于2020年12月22日更新。

质粒植物CRISPR克里普尔克由于其易于使用和在各种各样的生物体中使用,已经在基因组工程世界掀起了风暴。虽然目前的大部分CRISPR研究集中于其在人类医学上的潜在应用(华尔兹,2016),但CRISPR的潜力植物基因组工程也在实现。有多种原因需要考虑使用基因组编辑来改变植物的遗传码,包括庄稼的发展,保质期更长以及抗病作物的发展增加农业收益率(Wang等,2016; Wang等,2014)。虽然使用传统的植物育种方法当然可以选择理想的性状,但这些技术是繁琐的,通常需要几轮的选择来分离感兴趣的表型。另一方面,基因组工程允许对调控理想表型的已知或可疑基因进行定向修饰。事实上,CRISPR已经被用于设计许多植物物种的基因组,包括常用的模式生物,如拟南芥和苜蓿,以及一些作物物种,包括土豆、玉米、番茄、小麦、蘑菇和水稻(Khatodia et al., 2016)。尽管CRISPR系统在大多数生物体中具有几乎通用的功能,但为了在植物细胞中进行基因组编辑,CRISPR组件的一些植物特异性改变是必要的。

这篇博文将概述使用CRISPR的植物基因组工程,重点介绍对CRISPR机制的具体修改,使CRISPR能够在植物中使用,并概述通过Addgene可供学术研究人员使用的各种植物基因组工程工具。

植物基因组工程的CRISPR组件

CRISPR可用于敲除、激活或抑制植物中的靶基因,其原理与在其他模式生物中开发的一般实验设计原则相同(见我们的CRISPR指南为了常见的Crispr Priciple)。然而,对常用的CRISPR质粒的植物特异性修饰是在植物细胞中使用CRISPR系统是必要的。与其他模型系统一样,表达链球菌Cas9或Cas9变体(以下简称Cas9)和单链引导RNA (gRNA)足以修饰植物细胞的基因组。gRNA的结构(由~20个核苷酸的靶向序列和~75个核苷酸的支架序列组成)在植物和其他生物之间是一致的,但用于驱动gRNA表达的启动子取决于所研究的细胞类型。在植物细胞中,gRNA的表达是通过将gRNA置于植物特异性RNA pol III启动子(如AtU6、TaU6、OsU6或OsU3)下游来实现的,这些启动子通常用于驱动各自物种中小RNA的表达。Addgene携带> 30“空的grna”骨干它含有植物POL III启动子和GRNA支架序列,并允许研究人员以最小的克隆需要靶向寡核苷酸。与其他模型系统一样,可以表达多个GRNA以一次性修改若干基因组基因座(获取有关多路复用GRNA的更多信息)。

CAS9通常用核定位序列标记,以增强靶向核,并且已经创建了几种密码子优化的CAS9变体,以增加特定植物物种或细胞类型(Belhaj等,2013)。基于核酸酶死Cas9 (dCas9)的激活子(如dCas9- vp64)或阻遏子(dCas9- krab或dCas9- srdx)也可分别用于激活或抑制植物细胞中的靶基因。Cas9的表达通常由植物源RNA pol II启动子驱动,该启动子调节较长的RNA(如基因表达的mrna)的表达。常用的Cas9表达RNA pol II启动子包括广泛表达的花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV 35S)或泛素启动子(Belhaj et al., 2013)。Addgene携带cas9基因敲除质粒,激活抑制在植物和许多上述的目标基因空的grna backbones也含有Cas9,可以同时表达Cas9和同一质粒的gRNA。

将CRISPR组件传送到植物细胞

农杆菌介导的转化一旦您为您的应用程序选择了正确的CRISPR组件,就该将这些组件交付给目标细胞了。请记住,有效地传递CRISPR组件对于任何CRISPR实验都是必不可少的,如果在你的细胞系中表达gRNA或Cas9失败将导致实验失败。CRISPR成分可以稳定或瞬时表达,这取决于传递方法和细胞类型。CRISPR组件可以使用标准的洗涤剂聚乙二醇(PEG)瞬时表达,尽管这种方法的应用仅限于原生质体细胞(细胞壁被去除的植物细胞)。另一种常见的递送方法是农杆菌介导的递送,哪一种使用土壤衍生的细菌一个grobacterium农作为一种携带感兴趣的基因进入靶细胞系或生物的载体(如图1所示)。更多信息农杆菌属介导的转换可以在其中找到博客。的PDGE DICOT基因组编辑套件来自Stuttmann实验室包含多种Agrobacterium-compatible,Cas9包含载体,准备好用于金门的介导克隆您的兴趣的GRNA。

近年来,deaminase-mediated基本编辑(胞嘧啶基础编辑器或腺嘌呤基础编辑器)和逆转录酶介导'编辑技术人员已被证明是优异的替代基因组编辑技术,特别是在人体细胞中。与此相反同源性定向修复,这些方法不涉及双链断裂(DSB)的形成,也不需要供体DNA。这些精确的编辑往往比HDR (Zhu等人,2019年回顾)。胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器均已问世为工厂开发的和植物的素质编辑已经存在为水稻开发由Yiping Qi的实验室和对于大米和小麦由CIXIA GAO的实验室。

最近开发的方法还可用于有效地将CRISPR-CAS9组件提供给植物。纳米粒子(碳纳米管,Kwak等,2019),DNA纳米结构(Zhang等,2019)或细胞穿透肽(Santana等,2020)和植物病毒(大麦黄色条纹叶片病毒(Gao等人。,2019) or sonchus yellow net rhabdovirus (Ma et al., 2020) have already been shown to be efficient ways to deliver CRISPR-Cas9 to plant cells and should be considered alternative to PEG or agrobacterium-mediated delivery.

总结

尽管CRISPR介导的基因工程在很多细节上都有所不同——启动子的使用、精确的蛋白质序列或结构域,以及传递的方法——但植物中CRISPR介导的基因工程的基础技术与它在其他系统中的应用并没有太大的不同。幸运的是,你不需要寻找很远的质粒,这些质粒具有针对你最喜欢的植物基因所需的植物特异性修改;你可以在植物中找到多种CRISPR应用的质粒可通过addgene获得。除了上面描述的质粒之外,Addgene还携带了一些用于创建植物表达质粒的CRISPR工具包,包括植物CRISPR来自Yiping Qi Lab的质粒MoClo植物部件套件Patron实验室的与存储库中的所有质粒一样,我们强烈建议您阅读相关的出版物或协议,以最大限度地利用您为实验选择的质粒,但是,如果您是与植物一起工作的,不要害怕尝试您的手在CRISPR。


植物载体在Addgene

参考文献

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