用ESPCAS9,SPCAS9-HF1和HYPACAS9增强CRISPR靶向特异性

泰勒福特

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所有CRISPR所证明出版物, 和质粒在那里,显而易见的是,CRISPR是一个突破性的技术,已经对研究产生了巨大影响,并且很快就会影响我们的日常生活。不仅对各种生物学科产生影响的克里普尔特,基础技术本身不断改善。Cas9变体已被修改为基因组编辑激活基因表达可视化基因组基因座, 和多得多。现在,来自Zhang,Joung和Doudna Labs的研究人员改善了Cas9核酸酶的目标特异性,具有工程变形:Espcas9.SPCAS9-HF1,&hypacas9.

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非目标问题

众所周知,CRISPR / CAS9基因组编辑可能导致非目标站点的不需要的变化。意味着通过CAS9酸酐酶变体,降低CAS9表达和用于靶向的截断GRNA序列,包括降低这些所谓的“偏离目标效应”;但是,这些选项可以很麻烦,可以降低目标效率,有时甚至可以增加偏离目标效果。认识到这些问题,研究人员张实验室广泛的研究所joung实验室在哈佛医学院,和Doudna Lab.在伯克利举行,通过改变Cas9核酸酶本身的核酸酶活性来减少CRISPR / CAS9的截止目标影响

ESPCAS9的设计和测试

查看Cas9核酸酶的结构(PDB ID:4OO8.4UN3.),Slaymaker等人。假设Cas9切割效率在靶向稳定靶DNA链时增加(23.)。稳定的绞线分离由2套相互作用维持:

1.非目标股线与Cas9 HNH和Ruvc核酸酶结构域形成的带正电荷槽之间的相互作用

2.靶链和GRNA之间的相互作用(参见下图)

因为偏离靶序列对GRNA具有较少的互补性,因此它们具有更高的改进双螺旋和降低CAS9切割效率的倾向。但是,这并不总是足以让偏离目标站点被削减。Slaymaker等人推出,如果它们在HNH / Ruvc槽中的正电荷降低,则它们可以削弱凹槽与带负电荷的DNA之间的相互作用,因此使基底束分离稳定。这种降低的股线分离与在非靶位点的GRNA结合所提供的弱分离将理论上降低偏离靶切割。

CRISPR STRAND分离

减少HNH / Ruvc槽的电性能,SlayMaker等。在32个单独的Cas9突变体中在整个凹槽中制备了各种丙氨酸取代。当测试他们切割的能力时emx1.在人胚胎肾(HEK)细胞中的基因座,这些初始突变体中的11个保留了WT CAS9的靶向活性,同时降低了已知的偏离靶基因座的脱靶活性。作者继续结合最佳这些突变,并在HEK细胞的多个基因组位置测试它们的组合突变体。进一步测试两个突变体,SPCAS9(K855A)和Espcas9(1.1),然后是一种检测基因组双链断裂的技术(保佑)揭示这些突变体不会在意外的位点导致脱靶效果,并且如预测的那样,降低了基因组的偏离目标效果。

Slaymaker等人进一步工作。表明这些突变体对HEK细胞没有毒性,并且类似的突变可以改善特异性Cas9来自于S.金黄色葡萄球菌。这意味着您可能对您的CAS9同性恋者施加类似的合理突变并得到改善的目标特异性。

SPCAS9-HF1的设计与测试

Kleinstiver等人和Joung实验室类似地认为如果他们可以削弱Cas9和DNA之间的序列独立相互作用,那么它们可以减少偏离目标切割(4.)。然而,而不是在非目标股线和Cas9中使用的相互作用弱化,而不是弱化相互作用,Kleinstiver等,通过突变N497A,R661A,Q695A和Q926A(SPCAS9-HF1含有所有四个突变),Kleinstiver等中断CAS9和靶DNA链的伯晶骨架之间的相互作用。虽然精确的突变与ESPCAS9中发现的突变不同,但对特异性的影响是相似的;与WT SPCAS9相比,SPCAS9-HF1在各种基因组位点相比时产生的较少的偏离目标切割。

知识CAS9的动态结构导致高度晕机的发展

研究人员在Doudna Lab.在伯克利最近添加了自己的hyp一种将Cas9变体(Hypacas9)加强了增强池池。在他们的工作中,陈等。2017年使用单分子FRET测量来确定CAS9的哪个部分对于核酸酶特异性可能是重要的。他们发现ESPC​​AS9(1.1)和SPCAS9-HF1在与靶位点结合后以无活性形式倒置,并提出这种停滞导致其增强的特异性。额外的工作表明,移动REC3领域中的突变促进了这种摊位。通过这种新的发现结构知识,与Joung实验室合作,他们使用了目标诱变来创造hypacas9.(SPCAS9 N692A / M694A / Q695A / H698A)。这个新的变体显示器可比目标活动在测试时的网站上类似或减少偏离目标活动比较的到ESPCAS9(1.1)和SPCAS9-HF1。

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CAS蛋白的未来可能性

凭着增强的特异性,Espcas9.SPCAS9-HF1,Hypacas9应该使研究人员能够制造哺乳动物细胞中的精确编辑并且可能会减少对应用和/或治疗环境中的目标效果的担忧。将各种伟大工具中发现的不同突变结合在一起进一步增强基因组的编辑特异性吗?我们希望你们中的一个能够很快回答这个问题!我们期待看到研究界如何利用这些工具,并兴奋地看到基因组工程的持续改进!

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参考

1. Slaymaker,Ian M.等人。“具有改善的特异性的理性工程Cas9核酸酶。”科学(2015):AAD5227。PubMed.PMID:26628643

2. Nishimasu,Hiroshi,等。“与引导RNA和靶DNA复合物中CAS9的晶体结构。”细胞156.5(2014):935-949。PubMed.PMID:24529477。pmed中央PMCID:PMC4139937.

3. Anders,Carolin等人。“Cas9内切核酸酶的PAM依赖目标DNA识别的结构基础。”自然513.7519(2014):569-573。PubMed.PMID:25079318.。pmed中央PMCID:PMC4176945

4. Kleinstiver,Benjamin P.等人。“高保真Crispr-Cas9核酸酶,没有可检测的基因组宽的偏离目标效果。”自然(2016)。PubMed.PMID:26735016

5.陈,杰斯等。“增强的校对管理CASP-CAS9目标准确性。”自然(2017)。PubMed.PMID:28931002


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