脑袋的演变:使用Cre-Lox进行神经元的多色标记

由玛丽传动装置

玛丽传动

Aav-brainby标记的海马Interneuron轴突的图象。CRISPR-CAS9基因组编辑可能是操纵基因表达的热新方法,但其他基因操作系统对生物学仍然有价值。在20世纪80年代发现的CRE-LOX重组是在空间上和时间控制基因表达的最重要的方式之一,特别是在体内模型,新的CRE-LOX技术仍在今天正在开发出来。在这篇文章中,我将突出颅骨多色标签系统的演变 - 是CRE-LOX持续效用的完美示例。查看我们以前的博客文章,质粒101:CRE-LOX,如果您需要快速底漆,请在CRE-LOX重组工作原理。

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CRE-LOX重组的进展包括诱导型CRE,例如Tamoxifen响应克雷特,CRE-LOX与FLP-FRT重组的偶联以产生另外的重组事件,以及替代LOXP位点的合成,以指定不同的重组模式。2007年,约书亚洗车哈佛大学的分子和细胞生物学系都利用了CRE-LOX的这些属性来创造颅脑鼠神经标记系统。Brainbow-1和-2进一步精致创建颅弓3.2。颅骨标签也已应用于其他系统中的细胞标记和谱系追踪,例如斑马鱼和果蝇。

为什么灌注?

Brainbow强调了生物学趋势对单细胞分辨率成像。Sanes和Lichtman努力创建大脑的地图,一个连接的连接,这将是神经元如何形成电路以及它们突触的地方。观看概述这篇文章底部的原理图对于颅骨系统之间的差异的基本概要。预脑前技术,例如Golgi染色,注射扩散标签或染色部分的电子显微镜,由于低分辨率或非常近期,因此需要开发新技术。在作为大脑中紧密包装和交织的结构中,需要鲁棒单细胞标记来区分单个细胞。

颅骨-1.0构建含有三种荧光蛋白质:RFP(红伟德2021足球欧洲杯买球平台色),YFP(黄色)和M-CFP(膜系束性青色)。如果没有CRE重组,则表达RFP。CRE可以介绍两种缺失中的一个以允许YFP或M-CFP表达;这些删除使用2 loxp变体定义(仅相同的loxp站点可以调节重组。)缺失是相互排斥的,因为删除除去另一个LOXP位点变体,防止进一步重组。Brainbow-1.1将系统缩放到四个荧光蛋白,通过三种LOXP变体指定的重组事件伟德2021足球欧洲杯买球平台,但原理保持不变。当不存在CRE时,表达了构建体中的第一荧光蛋白,OFP(橙色);随机CRE切除导致三种重组中的一个,随后的重组不能发生。

虽然脑袋1系统使用CRE介导的缺失,但颅骨-21的设计巧妙地结合了CRE介导的缺失和反演。这颅骨-21构建可以表达四种颜色中的一种(N-GFP,RFP,YFP或M-CFP。)构建体含有两个串联可逆的段,每个段具有两个相反取向的荧光蛋白质编码序列。CRE介导的切除消除了一个段,消除了两种颜色可能性。只要CRE仍然表达,剩余的盒即可转换;一旦从系统中移除CRE,将表达编码序列最接近启动子的荧光蛋白。该系统与脑袋-1.0不同,因为需要瞬时CRE重组以防止构建体的恒定反转。

可以使用灌注本的不同颜色组合表。

Sanes和Lichtman使用经核注射将这些颅骨构造插入小鼠。当它们成像鼠标大脑时,它们由于构建体的多个副本的串联集成而发现了多于3-4种颜色(颅骨-1.0小鼠的约8)。多个独立的重组事件的组合效果导致彩虹颜色。有三个构造副本,人们会期望十种颜色(见右图);在各种报告中,由于副本数量较高,Sanes和Lichtman从90-160个不同的颜色观察到。展示展示展示真正适合这种丰富的技术。

优化系统:Brainbow-3

虽然灌注手为标记单个神经元所需的大量颜色提供了神经科学家,但该系统也遭受了许多限制。首先,由于低荧光强度,部分通过荧光团光源性,以及荧光团在神经元的躯体中聚集引起的荧光强度,颅脑组织的成像是挑战。其次,该系统不允许通过免疫染色分析。虽然所用的荧光团是荧光的,但它们的蛋白质序列是高度同源的,防止每个荧光团特异的抗体设计。第三,颅骨-1和颅骨-2每个都包含一个“默认”状态;例如,当构建体没有经过重组时,脑筋-1.0表达RFP。这种默认状态被大多数神经元表达,这限制了在给定区域中可以观察到的不同颜色的数量。

2013年,Dawen Cai等人。发布了猜测技术的改进,颅骨-3.0,目标是克服上面列出的限制。首先,它们筛选各种荧光蛋白,以找到具有理想特性的那些(在固定后的低聚伟德2021足球欧洲杯买球平台集,高光稳定性和高稳定性。)从七个所产生的蛋白质中选择了3种荧光和序列重叠的低水平(珊瑚Morange2),水母EGFP和海葵MKATE2。)然后它们成功地生成了对这些蛋白质中的每一个的定制抗体,并证实没有交叉反应性,打开门用于免疫染色分析。为了实现均匀的细胞标记,它们产生荧光蛋白的法釜化衍生物,其直接被贩运到细胞膜。伟德2021足球欧洲杯买球平台法金黑化衍生物的膜贩运使得能够用脑袋-1和-2的突出可见的精致轴突和树枝状过程。

颅骨-1.0的一般结构保留在脑筋-3.0中,但Morange2,EGFP和MKATE2作为荧光团;Morange2是默认状态。相比之下,脑袋-3.1和-3.2由于在启动子之后的推动堵塞盒的添加,请勿显示默认荧光。止动盒包括不荧光的突变YFP,但可以通过免疫染色来检测。该特征有助于筛选Cre-Digal脑袋小鼠以确定表达构建体的细胞的数量和类型。由于增加了啄木枝肝炎病毒后转录调节元件(WPRE),颅骨-3.2的光稳定性得到改善,通常用于增加转基因蛋白水平。

颅骨系统之间变化概述

猜测版本1,2和3之间的变化概述。

颅骨变形和超出小鼠脑的应用

除了改善颅骨系统外,Sanes和Lichtman还开发了一个互补FLPBOW构造这在功能上类似于基于CRE的脑袋,但是由FLP / FRT重组酶控制。当放置在不同的启动子下时,灌注本和鳞片式可用于标记不同的细胞群。

减少用脑袋转基因和CRE,Cai等人产生动物所需的动物滋养。也创造了一个自动构建包含CRE和XFP。CRE生产推动重组和XFP选择,然后是CRE自我切除。这些构建体稳定地通过至少六代维持。

除了神经元pthy1-brainbow构造,Addgene还有两个展示腺相关病毒载体(AAV)可用 -伟德BV下载AAV-EF1A-BBCHTAAV-EF1A-BBTAGBY。由于与AAV相关的尺寸限制,这些构造包含两个XFP;两个构造的共同感染至少产生8种颜色。AAV的使用提供了空间和时间控制,而无需种系改性,并且可以以各种物种使用归档。

其他实验室创建了更多变体,包括描述的R26R-COURETIHugo J. Snippert等。(2010)和魔术标记策略描述Karine Loulier等人。(2014)

目前,颅骨技术也适用于研究模型生物,如果蝇和斑马鱼。在果蝇中的颅骨在神经电路的映射中,例如电机神经元与神经肌肉交界处的连接。在斑马鱼中,该方法在谱系追踪中非常有用;“斑马”用于追踪角膜上皮的发展。

对于对神经科学和发展感兴趣的科学家来说,由于各种阵列和颜色的高稳定性,颅骨是标记和遵循单细胞的宝贵工具。Sanes和Lichtman估计,脑袋的彩色标签已经减少了脑的给定部分的映射时间至少是至少一个数量级。很明显,颅骨技术的进一步改进将为大脑和其他生物系统的复杂物理组织提供重要的见解。

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参考:

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改进档案工具箱的工具。Cai D,Cohen Kb,Luo T,Lichtman JW,Sanes Jr。自然方法2013年5月5:10(6):540-7。DOI:10.1038 / nmeth.2450。EPUB 2013 5月5日。PubMed.

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组合标签的多路复用电池和谱系跟踪。Loulier K,Barry R,Mahou P,Le Franc Y,Supatto W,Matho Ks,Iengs,Fouquets S,Dupin E,Benosman R,Chédotala,beaurepaire e,morin x,留下J.神经元。2014年2月5日; 81(3):505-20。PubMed.


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