扩大腺嘌呤碱基编辑器的靶向范围和编辑效率

由苏珊娜Bachle

David Liu的实验室创造了第一个基本编辑在2016年(Komor等人,2016年),并一直试图扩大其精确编辑能力。基本编辑使特异性DNA碱变为变化,并由融合到DNA改性酶的催化受损的CAS蛋白(DCA或CAS酸酐),在这种情况下是脱氨酶。来自C•G-TO-T•A的基础变化由胞嘧啶基础编辑器(CBE)介导,并且来自A•T-To-G•C的基础变化由Adenine基础编辑器(ABES)介绍。这是如何运作的?通过分子生物学团队合作。引导RNA(GRNA)指定DNA上的编辑靶位点,CAS结构域将改性酶引导至靶部位,并且脱氨酶诱导DNA碱的变化,而无DNA双链断裂。但基础编辑并不完美。它们可能很慢,只能瞄准某些网站,或者只制作基替代的子集。

需要速度:CAS之前的基本编辑让我们走

David Liu做了一个关于碱基编辑和初始编辑的演讲
图1:David Liu在本月早些时候的“细胞专题讨论:基因和细胞为基础的治疗:CRISPR,干细胞和超越”会议上发表讲话。

碱基编辑器的另一个问题是,在Cas域离开DNA之前,编辑域必须诱导碱基变化。ABEs有些缓慢,需要一个强大的Cas9结构域在DNA上“保持”足够长的时间来诱导碱基变化。因此,除了SpCas9之外,ABEs与许多Cas域的兼容性很弱。为了拓展ABEs基因编辑的应用和靶向范围大卫刘的实验室开始进化出与Cas同源物更具兼容性的ABEs。

在噬菌体的帮助下发展更好的基础编辑器!

来自刘实验室的最新ABE是ABE7.10它含有脱氧腺苷脱氨素酶,TADA-7.10(Gaudelli等,2017)。这个想法是为了演化达达-7.10版本,脱胺率较快,以便在CAS同源物放开之前,可以发生脱胺。刘实验室开发了噬菌体辅助连续演进(速度)和噬菌体辅助的非连续演进(PANCE)选择系统,更好,更快的APES(图2)。这些系统允许通过许多突变,选择和每天复制来快速连续蛋白质演进。

PACE和PANCE系统使用M13噬菌体,这依赖于基因III的表达来制造感染性颗粒。细菌中一个基于质粒的遗传电路将基因III的表达与碱基编辑器的活性和编辑速度联系起来,它由以下部分组成:

  • 表达DCAS9的宿主细菌中的质粒
  • 表达基因III的宿主细菌中的质粒。基因III在T7 RNA聚合酶的控制下,不能表达,直到碱基编辑器校正T7 RNAP内的早期止血密码子。
  • 编码脱氨酶TADA-7.10的噬菌体
  • 控制噬菌体突变率的诱变质粒

噬菌体感染产生一个完整的ABE蛋白。如果噬菌体提供了一个活性的碱基编辑器变体,一个功能基因III产物可以感染细菌细胞。如果一个噬菌体没有传递一个活跃的变种,该噬菌体是没有传染性的。编辑速度决定了哪种噬菌体变异的繁殖速度比稀释速度快(从被感染的细胞传代到新鲜的未感染的宿主细胞培养)。这一稀释步骤代表了PACE和PANCE之间的主要区别:对于PANCE,噬菌体后代没有被稀释,而是人工从受感染的宿主细胞培养物传代到未受感染的培养物,这导致整体稀释程度较低,噬菌体选择的严格程度较低。

噬菌体辅助进化碱基编辑活性的工作流程
图2:噬菌体辅助演化的基础编辑活动。细菌中基于质粒基遗传循环将基因III的表达与基础编辑活动和编辑速度的表达联系起来。

介绍一种快速灵活的腺嘌呤碱基编辑器——ABE8e

低严格的PANCE,之后是较高的严格速度,导致与原始TADA-7.10酶相比具有更高的基础编辑活性的TADA变体的演变。在测试众多TADA变体后,它们识别了TADA-8E,其比TADA-7.10更快地编辑590倍。它与所有CAS9和CAS12同源物兼容,研究人员在包括SPCAS9,SACAS9,LBCAS12A,ENASCA12A,SPCAS9-NG,SACAS9-KKH,CP1028-SPCAS9和CP1041-SPCAS9。这结果基编辑器命名为ABE8e。ABE8e不仅速度快,而且可以多路融合:当被要求纠正阻碍胎儿血红蛋白基因表达的两点突变时,ABE8e同时完成了这两种变化,效率为54%,约为ABE7.10的7倍。

然而,ABE8E的增加的编辑速度和靶向范围具有代价:ABE8E显示出越靶DNA和偏离靶标RNA活性。为了缓解该缺点,实验室将额外的突变(V106W)引入TADA-8E,并得到的ABE8E(TADA-8E V106W)在靶DNA上作为ABE8e的较高,同时保持下靶DNA和关闭目标RNA编辑ABE7.10的编辑率。

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为什么工程师和优化基础编辑器?

自然产生的酶和功能域的靶向进化加快了朝着更快、更精确的碱基编辑器的发展,能够编辑以前不可编辑的序列。四种DNA碱基交换,即所谓的点突变,即C变T, G变A, A变G, T变C,代表了已知的三分之二的致病点突变。胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器一起可以纠正所有这四种点突变,理论上可以将与疾病相关的基因转换回野生型。通过将ABE8e添加到碱基编辑工具箱中,科学家现在可以在更多的情况下更有效地进行这些编辑。

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参考

Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, Liu DR(2017)基因组DNA A•T到G•C的可编程碱基编辑。自然551:464 - 471。https://doi.org/10.1038/nature24644

Richter MF, Zhao KT, Eton E, Lapinaite A, Newby GA, Thuronyi BW, Wilson C, Koblan LW, Zeng J, Bauer DE, Doudna JA, Liu DR(2020)噬菌体辅助进化腺嘌呤碱基编辑器,提高Cas结构域相容性和活性。自然生物技术。https://doi.org/10.1038/s41587-020-0453-z

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主题:CRISPR,基本编辑

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