和夏洛克和侦探一起寻找核酸

由Alyssa Cecchetelli

最初发布2018年8月30日,并更新了2020年4月16日。

夏洛克与区墨核酸检测方法的比较

敏感和特异性的核酸检测对于临床诊断、基因分型和生物技术进步至关重要。然而,许多核酸检测方法要么缺乏对低浓度核酸检测的敏感性或特异性,要么成本太高、耗时太长、复杂,无法在标准实验室之外使用。在COVID-19大流行的情况下,qPCR可用于诊断SARS-CoV-2 RNA的存在,但试剂和设备供应不足已成为一个瓶颈。

在过去的几年里,科学家们利用了CRISPR-Cas9蛋白变异,CAS13, 和CAS12A,开发简单,便携和廉价的平台,可靠地检测到原子水平的核酸。

张实验室已经适应Cas13蛋白的天然RNase活性来发展和优化称为特异性高灵敏度酶解报告物解锁(《神探夏洛克》Sherlockv2.)(Gootenberg等人,2017年和2018年)。而Doudna实验室使用CAS12A的非特异性SSDNA劣化来开发所谓的方法DNA内核酸酶有针对性的CRISPR反式记者(贬值)(陈等人,2018)。

SHERLOCK和DETECTR分别利用Cas13和Cas12a对邻近的ssRNA和ssDNA的混杂切割和降解来切割和激活一个报告基因。来自该报告者的可检测信号可以被测量和量化,以确定DNA、RNA或感兴趣的突变的存在和数量。SHERLOCK和DETECTR一起展示了基于crispr的诊断的威力。

Sherlock-特异性高灵敏度酶报告者解锁

Cas13 (C2c2)于2016年首次被发现由张实验室作为RNA引导RNase(Abudayyeh等人2016年)。CAS13可以由单个CRISPRNA(CRRNA)引导以切割SSRNA或mRNA。它还表现出非特异性SSRNA裂解的“抵押效应”。

夏洛克是怎么工作的?

CAS13可以用CRRNA编程以靶向感兴趣的SSRNA,例如,特异于病毒或病原体的序列。一旦CAS13识别并结合编程序列,它可以围绕SSRNA分子术语迅速地切割。在Sherlock中,将猝灭的荧光SSRNA报告称为反应。通过“活化”CAS13产生淬火荧光RNA的切割产生量化信号,表示靶向核酸的存在。为了提高测定的敏感性,首先使用RPA(重组酶聚合酶扩增)或逆转录酶(RT)-RPA来扩增来自样品的靶向DNA或RNA。RPA与T7转录偶联以将扩增的DNA转化为RNA,以便通过CAS13进行后续检测。该扩增步骤与SSRNA报告者组合使Sherlock能够检测具有热摩尔敏感性和单碱基对失配特异性的DNA或RNA。

Sherlockv2.

在2017年首次推出时,Sherlock有一些限制,因此实验室进一步修改了改进其检测系统。他们命名这个系统Sherlockv2.对于Sherlock版本2.以下是一些改进:

  • SherlockV2在预放大步骤中使用远更少的底漆,允许更大的定量而不损害灵敏度。
  • 为了在一次反应中检测多个靶,CAS酶,例如Cas13和Cas12a的变化,与每个酶的不同荧光报道组合。
  • 此外,CSM6是CRISPR型-II效应核酸酶,可以与CAS13结合使用以放大单个目标的信号。CSM6可以切割SSRNA与感兴趣的CRRNA互补(Niewoehner和Jinek,2016),由Cas13 SsRNA裂解副产品方便地激活。因此,CAS13与编程的感兴趣区域的结合将导致CAS13特异性报告者的切割和CSM6的激活。张实验室表明,通过添加CSM6和CSM6特定报告器(在与CAS13报告的同一荧光通道中),它们可以显着放大单个目标的检测信号。
  • 对SHERLOCKv2进行了修改,这样就可以在商业横向流试纸条上检测到剪切报告物,类似于妊娠测试。与横向流动条带,你的DNA或RNA的利益在一个给定的样本的存在只是由条带上的条带的数量决定。这种类型的读数允许几乎任何地方的核酸检测,因为横向流条易于运输和快速工作,在短短一小时内提供可靠的结果。

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Sherlock检测系统的应用

张实验室表明,Sherlock可以可靠地区分Zika和一个密切相关的病毒,从多个样本来源登革热。Sherlock还可以检测来自无细胞DNA片段的低频癌突变,以及来自人唾液的健康相关的单核苷酸多态性(SNP)。

Sherlockv2提供了一种检测具有高灵敏度和特异性的核酸的方法,而不会损害速度,易用性和便携性。该方法可用于包括临床诊断(例如病原体或病毒检测),治疗剂和敏感基因分型的应用阵列。Sherlock Systems的美丽是它可以在实验室和野外使用中使用方便、有效(Myhrvold等,2018)。

现在,张实验室共享了一个使用Sherlock检测SARS-COV-2 RNA的协议。该测试使用从患者样本中纯化的RNA,使用试纸在一小时内即可读取。而实验室指出在这一点上没有批准临床用途他们希望该协议能成为一个推进诊断的平台。

DEDECTR-DNA内切核酸酶目标CRISPR TRANS记者

Cas12a (Cpf1)是CRISPR cas1的变种这也可以将DSDNA与Cas9相似(Zetsche等人。,2015年)。Cas12a识别不同的PAM位点,并在dsDNA断裂后产生5 '和3 '交叉末端。杜德纳实验室发现Cas12a具有切割非特异性(反式) ssDNA,并利用这种能力创建了一个名为det

贬值工作如何?

转速与夏洛克类似。CAS12A通过CRRNA靶向特异性DNA序列,例如人乳头状病毒(HPV)基因组。将SSDNA-荧光淬火(FQ)报告器,其将在SSDNA降解时产生信号,加入到反应中。为了增强灵敏度,首先通过RPA等温扩增来扩增DNA。当CAS12A-CRNA碱基对具有感兴趣的DSDNA时,开始CAS12A的DNase活性。周围transSSDNA,包括SSDNA-FQ记者随后以每秒〜1,250切的速率降低。在这种情况下,可量化的荧光信号表示感兴趣的DNA的存在,HPV。

作为概念证明,实验室证明,在一小时内,降低可以在人体细胞的两种类似类型的HPV,HPV16和HPV18之间进行准确地区分。因此,降低能力能够快速检测具有高选择性和患者样品敏感性的核酸。

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评标诊断的应用

DETECTR可以简单有效地检测混合人群中的核酸,用于分子和临床诊断应用。该公司庞大的生物科学已经基于贬值技术开始的使命“提供了一种基于CISCRP的平台,可以建立在生物腐肉中的生物腐蚀态的无限次数。

猛犸生物科学公司和加州大学旧金山分校改编了贬值平台来检测SARS-COV-2使用横向流条格式。他们在自然生物技术。与SHERLOCK探测系统一样,DETECTR尚未被批准用于诊断,但正在进行验证研究。

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云顶娱乐 韦德国际Jennifer Tsang对本文的更新做出了贡献。

参考

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