量化DNA ?以下是五种DNA定量方法

由詹妮云顶娱乐 韦德国际弗曾

blugene -持有dna - 300 px你已经准备好了你的DNA你已经准备好了下一步的实验。但在很多情况下,你在净化后的最后一根试管中看不到任何DNA的迹象。你怎么知道你的试管里是否真的有DNA而看不到呢?

有很多方法可以做到这一点,您所选择的方法可以基于您的下游应用程序、时间和工具可用性。

紫外吸光度

利用紫外吸收是量化DNA最常用的方法之一。这种方法包括测量光通过液体的吸光度/透射率,以确定液体中物质的浓度。分子不同程度地吸收不同波长的光,许多分子都有其最大吸收的特定波长。分光光度计用紫外透明比色管测量这些吸光度。首先你测量DNA缓冲液的吸光度。这是一个“空白”和测量背景的吸光度。然后测量DNA样本的吸光度。

这些吸光度测量可以让你知道你的DNA预备的浓度以及是否有其他污染物。核酸(DNA和RNA)在260nm时吸收最大。蛋白质在280nm处吸收最佳,有机化合物和混沌盐在230nm处吸收最佳。A260/A280比值作为DNA纯度的指标。理想情况下,这个数字应该在1.8和2.0之间。如果A260/A230比率大于1.5,则最佳。

然后,使用A260读数,你可以计算出DNA浓度。一般来说,1.0的A260相当于50 ug/ml的纯dsDNA。使用下面的公式来估算你的DNA:

浓度(ug/ml) = A260读数×稀释倍数× 50 ug/ml

该方法简便快捷,不需要任何特殊试剂。然而,它在低浓度的DNA中灵敏度有限,而且不能区分DNA和RNA。

参见我们关于使用紫外吸收光谱来量化DNA的方案

荧光染料

另一种量化DNA的方法是使用荧光染料,这种染料与DNA结合时会发出荧光。这里的主要区别是,这些染料,如PicoGreen或SYBRGreen,是专为双链DNA(与测量所有核酸的分光光度法相比)。这些方法比紫外吸收法更敏感,特别是当你期望样本中的浓度较低时,通常用于下一代测序的DNA量化。

与基于吸光度的方法不同,基于荧光的方法需要一个标准曲线,一组已知DNA数量的样本及其相应的荧光。这样,你就可以将你的样本的荧光与这条曲线进行比较,从而量化你的DNA准备。虽然这种方法需要更多的时间在实验室设置,你可能不需要自己计算,因为许多荧光计会为你计算你的样本浓度。

琼脂糖凝胶电泳

虽然这不是最快的量化DNA的方法,但你可以使用琼脂糖凝胶法,不仅可以发现你有多少DNA,还可以查看你的DNA是否完整或大小是否正确。这是基于吸光度的方法无法告诉你的你不需要分光光度计或荧光计来量化DNA。

首先,先把你的凝胶含有DNA插入染料(如溴化乙锭),并选择已知浓度的DNA阶梯。许多商业的DNA图谱会告诉你图谱中每个条带的浓度。然后你运行不同稀释度的DNA样本,并根据DNA的波段强度相对于阶梯的强度进行量化。最好的方法是比较与你的DNA片段大小最接近的阶梯片段的条带强度。这种方法最适用于DNA片段(如PCR产物)。这种方法也给出了一个指标的DNA或RNA污染的基础上存在其他条带或条纹。与基于吸光度的方法不同,这种方法不会告诉你污染的蛋白质或混乱盐。

毛细管电泳

毛细管电泳DNA定量与凝胶电泳DNA定量类似。除外,它是小。和自动化。

不像凝胶电泳,你只需要1-2 ul的样品和运行时间只是几分钟每个样品。在运行过程中,DNA片段通过微或纳米流体通道,样品通过电泳分离。较小的片段比较大的片段迁移得更快。这些片段随着时间的推移被定量使用荧光染料插入到DNA中,这样小的片段在大的片段之前先被定量。

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图1:使用毛细管电泳对RNA阶梯的定量,显示随时间变化的荧光单位。较小的片段比较大的片段迁移得更快。从图片OpenWetWare

这种方法常用于下一代测序或微阵列研究,不常用于标准质粒制备。

二苯胺法

另一种基于吸光度的DNA定量方法是使用二苯胺。二苯胺在酸性条件下与脱氧核糖糖反应,形成一种可在595 nm处定量的蓝色络合物。

该方法耗时长,灵敏度低,不常用。但是,测量是在可见范围内进行的,如果没有其他仪器,可以用标准ELISA阅读器读取。

最后一些关于DNA定量的提示

在选择DNA定量方法时,需要考虑很多因素:成本、时间、设备和预期DNA浓度。重要的是要考虑每种方法的优点和缺点,以及什么时候一种方法可能比另一种更适合。

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